丁酸盐在TNBS诱导的结肠炎小鼠中的保护作用研究

摘要

研究背景: 炎症性肠病（IBD）的发病率成逐年上升的趋势，其确切发病机制目前为止仍不是十分清楚。除与个体生物的遗传易感性密切相关之外，还有可能受到肠道菌群失调、免疫调节失衡或是肠组织炎性损伤等多种因素的综合影响。尤其是脾脏中的T淋巴细胞和肠组织巨噬细胞在IBD的发病过程中起到关键作用。丁酸盐作为肠黏膜益生菌代谢产物短链脂肪酸中重要的一种，不仅可以在肠腔内提供能量和营养物质，还可以对整个肠道起到很好的调节和保护作用。但丁酸盐在调节IBD具体发病机制以及对IBD进行保护和治疗等方面目前为止研究较少，因此更加值得对此进行深入研究。 目的: 本实验用TNBS诱导的BALB/c小鼠建立起可以模拟人类IBD发病机制的结肠炎模型，并在建模过程中同时给予丁酸盐溶液和等量的丁酸梭菌菌液进行灌胃，从而对丁酸盐是否调节了结肠炎小鼠脾脏组织中 Th1/Th2的免疫平衡，以及是否抑制了肠道内中性粒细胞的增殖和M1/M2型巨噬细胞的平衡等进行了初步研究。之后进一步对丁酸盐是否调节了脾脏组织中PD-1/PD-L1信号途径进行了深入研究，更加说明了丁酸盐在结肠炎小鼠中具有一定的调节和保护作用，同时也为IBD在临床上的治疗和应用提供新的方法与依据。 方法: 将 60 只雄性 BALB/c 小鼠随机分为①正常对照组、②TNBS 模型组、③TNBS+丁酸盐组和④TNBS+丁酸梭菌组四组。饲养过程中对各组小鼠进行体重、死亡率等一般状况的检查并进行 DAI评分，三周后处死全部小鼠并对各组小鼠结肠组织进行HE染色和HI评分比较。之后用ELISA试剂盒检测各组小鼠肠组织MPO的表达水平和血清内IFN-γ、IL-4、IL-17、TGF-β和IL-10的浓度。并在各组小鼠脾脏组织中用 Western Blot 方法检测 Foxp3 蛋白的表达以及用qPCR方法检测PD-1和PD-L1的mRNA表达量。最后在各组小鼠结肠组织中用免疫组化方法检测CD86和CD206的表达情况和ELISA方法检测趋化因子受体和配体CCL2、CCR2、CCL17和CX3CR1的表达量。 本实验的所有数据均用SPSS 21.0统计软件进行处理。计量数据采用平均数±标准差（-x±s）的方式表示，多组数据间采用单因素方差分析方法，方差分析有意义时再进一步用 LSD-t 检验进行两两比较。对各组免疫组化结果的比较采用卡方检验。检验水准为α=0.05，p<0.05时认为具有统计学意义。 结果: ①正常对照组小鼠一般状况良好，体重轻度增加，无死亡现象并且 DAI评分和HI评分均在正常范围内。②TNBS模型组与①正常对照组小鼠相比一般状况较差，死亡率有所增高体重也有所减轻，并且DAI和HI评分也出现升高。而③TNBS+丁酸盐组和④TNBS+丁酸梭菌组与②TNBS 模型组小鼠相比其一般状况、体重和死亡率等指标均有所缓解，DAI评分和HI评分也相对降低。差异具有统计学意义（p<0.05）。 与①正常对照组小鼠相比，②TNBS模型组肠组织MPO的ELISA值有所升高，血清内IFN-γ和IL-17的ELISA值升高，而TGF-β和IL-10的ELISA值有所降低。③TNBS+丁酸盐组和④TNBS+丁酸梭菌组与②TNBS 模型组小鼠相比肠组织MPO的ELISA值有所恢复，血清内IFN-γ和IL-17的ELISA值相对降低，并且 TGF-β 和 IL-10的ELISA 值同样有所回升。差别具有统计学意义（p<0.05）。但是四组小鼠血清内IL-4的ELISA值比较没有较大差别（p>0.05）。 ②TNBS模型组与①正常对照组小鼠相比，脾脏组织中Foxp3的表达量有所降低，并且PD-1和PD-L1的mRNA表达量也相应降低。而③TNBS+丁酸盐组和④TNBS+丁酸梭菌组与②TNBS 模型组小鼠相比脾脏组织中 Foxp3的表达相对增高，并且PD-1和PD-L1的mRNA表达量也有所回升。差别具有统计学意义（p<0.05）。 ②TNBS模型组与①正常对照组小鼠相比，结肠组织内CD86的免疫组化表达量有所增加，CD206的免疫组化表达量相对降低。肠组织CCL2和CCR2的ELISA 值均出现增高并且 CCL17 和 CX3CR1的ELISA 值均有所降低。而③TNBS+丁酸盐组和④TNBS+丁酸梭菌组与②TNBS 模型组小鼠相比 CD86的免疫组化表达量相对减少，CD206的免疫组化表达量出现回升。并且肠组织CCL2和CCR2的ELISA值出现降低，CCL17和CX3CR1的ELISA值相对增高。差别具有统计学意义（p<0.05）。 结论: 1.丁酸盐既可以初步改善结肠炎小鼠中的临床表现和基本病理情况，还可以改善和调节脾脏组织中Treg细胞的数量和相应的免疫平衡，同时抑制结肠组织内中性粒细胞的增殖和巨噬细胞分型的失衡。 2.丁酸盐可以通过诱导脾脏组织中PD-1/PD-L1信号通路的方式从而促进了Treg 细胞的增殖。并可以在结肠组织中通过抑制巨噬细胞表面趋化因子受体和配体表达量的方式从而对结肠组织中M1/M2型巨噬细胞数量的平衡进行调节。 3.丁酸梭菌作为肠道内重要益生菌中的一种，也可以在TNBS诱导的结肠炎小鼠模型中起到与上述丁酸盐相类似的保护调节作用。

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