肿瘤特异“开--关”型高分辨率磁共振成像纳米探针研究

摘要

恶性肿瘤严重危害着人类的生命和健康。成像介导的诊断和定位对恶性肿瘤的发现、确诊和治疗至关重要。在众多的成像技术中，磁共振成像(Magneticresonance imaging，MRI)由于其高强度、高软组织分辨率、无显著辐射损伤、可任意方位断层扫描的技术灵活性等优点而广泛应用。MRI的灵敏度和分辨率主要依赖于成像造影剂(Contrast agents，CAs)。但由于传统CAs具有体内分布特异性低、对比度差、显影时间短等缺点，MRI在恶性肿瘤诊断中仍受到了较大的限制。为了进一步提高肿瘤MRI的分辨率和灵敏度，本课题拟构建一种基于肿瘤特异微环境特征的“开-关”型MRI纳米探针，同时具备肿瘤靶向及体内长循环能力，以显著提高MRI的成像效率，实现对肿瘤的高分辨率、高特异成像。 为使MRI具备肿瘤特异的“开-关”特征，本课题基于磁共振调谐(Magnetic resonance tuning，MRET)理论来控制MRI信号的“开启”与“关闭”，即通过智能调节超顺磁性物质(猝灭剂)与顺磁性造影剂(增强剂)之间的距离来实现MRI信号的“开-关”转换。因此，该肿瘤MRI纳米探针主要分为两个单元:(1)MRET效应单元——具有超顺磁性和介孔特性的中空介孔氧化铁纳米粒(Hollow mesoporous iron oxide nanoparticles，HMINs)高效装载顺磁性CAs三氯化钆(Gadolinium(Ⅲ)chloride，GdCl3)。(2)肿瘤智能响应门控单元——具有透明质酸酶(Hyaluronidase，HAase)特异响应性的透明质酸(Hyaluronic acid,HA)包封上述纳米粒，最终得到具有肿瘤特异响应性的MRI纳米探针HA-HMIN@Gd。当该纳米探针在低表达HAase的正常组织中，Gd被封堵在HMINs孔道内部，由于HMINs产生的强磁场对Gd自旋磁场的猝灭作用，MRI信号被有效“关闭”;当纳米探针被递送至肿瘤组织后，由于肿瘤微环境存在高浓度的HAase，封堵在HMINs表面的HA发生特异性降解，孔道被打开，Gd快速释放，Gd与其猝灭剂HMINs间的距离显著增大，实现MRI信号的“开启”。 首先，本课题通过水热法合成HMINs，利用扫描电子显微镜(Scanning electron microscope，SEM)、透射电子显微镜(Transmission electron microscope，TEM)、X射线衍射(X-ray diffraction，XRD)测试证明HMINs的成功制备，其粒径大小约为215nm。通过比表面积和孔径分布的测试得到HMINs比表面积为139m2/g，平均孔径为6.05nm，总孔容为0.369cm3/g，进一步证明中空介孔结构的存在。磁滞回线结果表明HMINs具有良好的超顺磁性。随后通过酰胺化反应在HMINs表面修饰HA，紫外-可见光吸收(Ultraviolet-visible，UV-Vis)光谱、傅里叶变换红外(Fourier transform infrared，FT-IR)光谱、热重分析(Thermogravimetric analysis，TGA)等表征结果证明纳米粒表面HA的成功修饰。采用析晶法装载GdCl3，能谱(Energy dispersive spectrometer,EDS)的mapping结果显示Gd的成功装载及均匀分布，利用电感耦合等离子体质谱(Inductively coupled plasma mass spectrometry,ICP-MS)测定得到载药率约为12.0％。 其次，本课题对纳米探针HA-HMIN@Gd的体外核磁成像行为进行考察。通过检测在体外有/无HAase存在下HA-HMIN@Gd的MRI信号强度，考察该探针的肿瘤特异性“开-关”效应。T1加权像(T1-weighted image，T1WI)显示，当在无HAase环境中，MRI呈现低强度T1信号，纵向弛豫率r1低至0.327mM-1s-1，表明HA-HMIN对Gd的MRI信号有猝灭作用;而在加入HAase共孵育后，出现高强度T1信号，r1为11.4mM-1s-1，约为无HAase作用时r1的30倍。由HA-HMIN和HAase共孵育后的热重曲线可知，上述所发生的信号转换与加入HAase后封堵在HMINs表面的HA被特异性降解有直接关系。HA-HMIN@Gd核磁成像能力对HAsse浓度及孵育时间的依赖性实验结果显示，在一定范围内，随着HAase浓度的加大及孵育时间的延长，Gd的释放量逐渐增加(在HAase浓度1.8nM和180nM时，Gd的8h释放率分别是26.6％和79.4％)，结合T1信号的随之升高现象可以确证MRET效应与Gd释放的匹配性，即在较高浓度HAase存在时，孔道内的Gd会快速释放，MRI信号由“关闭”转换到“开启”。通过在不同生理环境中的MRI实验可知，HA-HMIN@Gd能高灵敏、高特异性地响应HAase。此外，细胞毒性实验结果显示HA-HMIN@Gd无明显细胞毒性，具有良好的细胞相容性，为进一步的体内研究奠定了基础。 随后，本课题以荷瘤小鼠为动物模型，考察纳米载体HA-HMIN在小鼠体内的分布情况，实验结果显示，HA-HMIN@IR783能高效聚集在肿瘤部位，具有较好的靶向作用。通过检测肿瘤组织和肝脏组织的HAase表达情况发现肿瘤组织的HAase含量远高于肝脏组织，这为HA-HMIN@Gd实现肿瘤特异“开-关”成像提供了生理基础。通过磁共振成像系统记录纳米探针在不同组织中MRI信号，结果显示在注射HA-HMIN@Gd后，肿瘤组织呈现高强度的T1场核磁信号，而正常组织则未出现高信号，表明该探针具有肿瘤特异响应性。对成像结果进行半定量统计可知，HA-HMIN@Gd组的肿瘤组织与正常肝组织的对比度、肿瘤组织与瘤旁组织的对比度最高分别达到2.17和1.74，约是等量传统CAs组(1.14和0.925)的2倍，显著提高成像对比度并延长了造影时间。ICP-MS结果显示，与肿瘤组织相比肝脏中的纳米探针积累较多，结合肝脏组织表现的低核磁信号现象进一步确证HA-HMIN@Gd具有肿瘤特异微环境“开-关”响应MRI能力。 最后，通过体外溶血实验和血常规检查发现HA-HMIN@Gd没有引起明显的溶血和血细胞凝聚等现象，表明其具有良好的血液相容性。通过健康小鼠给药后的脏器系数和组织切片染色等结果可知，HA-HMIN@Gd具有良好的组织相容性。这些结果证明HA-HMIN@Gd在使用浓度下无明显毒性，具有良好的生物相容性，有望用于体内MRI。