白菜型油菜单倍体减数分裂的细胞遗传学研究

摘要

白菜（Brassica rapa，AA，2n=20），在物种进化过程中先后经历多次全基因组复制以及随后的二倍体化（diploidization）事件，形成现在的栽培种二倍体白菜，在基因组结构上是一种较为典型的中生代六倍体（mesohexaploid）。减数分裂是真核细胞进行有性繁殖所必需的，经过染色体分离最终产生单倍体配子以形成后代。本实验通过小孢子培养技术人工诱导获得白菜型油菜单倍体（n=×=10），对其雄配子体发育过程以及减数分裂过程中非同源染色体行为进行细胞学水平和转录组学水平的分析。首先通过流式细胞法与体细胞染色体计数法进行倍性鉴定，筛选合适的实验材料。对表型性状进行观察测量，分析白菜型油菜单倍体植株生长发育的特征。同时利用显微技术对单倍体花器官、花药、花粉粒发育的不同层次进行观察。着重分析了单倍体减数分裂过程中非同源染色体配对、联会、分离等细胞遗传学行为。最后利用转录组测序及荧光定量PCR分析单倍体中减数分裂和雄性不育相关基因的差异表达情况，探究调控白菜型油菜单倍体减数分裂过程以及花粉粒发育的分子机制。研究结果表明： 1、通过小孢子培养技术人工诱导获得白菜型油菜单倍体。表型鉴定显示单倍体的生长发育特点和器官形态上与二倍体相比差异显著，随着倍性降低植株高度、花器官尺寸明显变小，单倍体花粉育性降低，雄配子体高度不育。 2、扫描电镜结果显示单倍体成熟花粉粒形态极少数呈饱满椭球形；大部分花粉粒皱缩、萌发沟内陷严重，为败育花粉粒。花苞横切显微观察发现减数分裂期单倍体药室内绒毡层提前脱离花药内壁；包含绒毡层细胞分泌物的小孢子外壁结构在减数分裂期出现不完全发育，这些细胞结构的异常发育均会导致花粉粒败育。 3、对白菜减数分裂过程非同源染色体行为进行显微观察，结果显示单倍体减数第一次分裂前期出现较高频率的非同源染色体联会、配对；终变期细胞中染色体以单价体、二价体和多价体多种形式存在，大部分细胞表现为三对二价体的染色体构型；中期出现少量偏离赤道板的染色体以单价体的形式在结构松散的纺锤丝牵引下排列在赤道板周围；后期，配对的非同源染色体分向细胞两极，单价体在纺锤丝牵引下随机分配。在单倍体减数第二次分裂后期姐妹染色单体分离，产生染色体数目不恒定的三分孢子或四分孢子。在白菜型油菜单倍体减数第一次分裂前期粗线期的免疫荧光检测中观察到联会复合体横向细丝蛋白ZYP1定位在染色体上，表明非同源染色体间发生配对、联会且形成了联会复合体，这种现象将导致染色体偏分离的频率降低，与二倍体相比单倍体形成的配子存在染色体缺失现象。 4、以白菜型油菜二倍体及单倍体花为材料，利用RNA-Seq高通量测序技术进行转录组学水平的分析，探究倍性降低后基因表达情况。在白菜型油菜单倍体花中参与修复相关的基因（DMC1，MSH2）大部分下调表达，但同源重组基因（RAD51，RAD54）大部分上调表达。推测在白菜型油菜单倍体中减数分裂重组途径受到破坏。 以上研究结果为后续深入分析白菜型油菜单倍体减数分裂期非同源染色体联会机制提供了理论依据，对解析基因组复制事件对植物生殖的影响具有重要意义。

目录

声明

1 引言

1.1 植物基因组复制事件对生殖发育的影响

1.2 植物单倍体研究进展

1.3高等植物减数分裂的研究进展

1.4 高等植物花粉的发育过程

1.5转录组测序技术在研究植物花药发育的研究进展

1.6研究目的及意义

2 白菜型油菜单倍体的鉴定及形态学分析

2.1 实验材料、实验仪器设备和试剂

2.2 实验方法

2.2.1 流式细胞法检测倍性

2.2.2 体细胞染色体计数

2.2.3 形态学分析

2.2.4 花药发育及花粉育性观察

2.2.5 花粉粒表面超微结构观察

2.3 结果分析与讨论

2.3.1 人工诱导单倍体的栽培

2.3.2 单倍体材料鉴定

2.3.3 白菜型油菜单倍体的表型分析

2.3.4 白菜型油菜单倍体气孔器鉴定

2.3.5 白菜型油菜单倍体花粉粒育性分析

2.3.6 白菜型油菜单倍体花粉发育过程的细胞学观察

2.4讨论

3 白菜型油菜单倍体减数分裂期花药发育的分析

3.1 实验材料、实验仪器设备

3.2 实验方法

3.2.1 石蜡切片

3.2.2 透射电镜

3.2.3 减数分裂期染色体片的制备

3.2.4 减数分裂期联会复合体蛋白免疫荧光定位

3.2.5 减数分裂期微管蛋白免疫荧光定位

3.2.6 转录组数据处理与比对

3.2.7 qRT-PCR 分析

3.3 实验结果

3.3.1 白菜型油菜单倍体花药横切观察

3.3.2 白菜型油菜单倍体花药发育的超微结构特征

3.3.3 白菜型油菜单倍体减数分裂过程

3.3.4 白菜型油菜单倍体减数分裂期非同源染色体高频联会现象

3.3.5 白菜型油菜单倍体减数分裂过程微管蛋白动态变化特征

3.3.6 白菜型油菜单倍体花器官转录组分析

3.3.7 qRT-PCR 对差异表达基因进行验证

3.4 讨论

4 结论与展望

参考文献

附录

个人简介与研究成果

致谢