婴幼儿脑组织中嵌合RNA的分析及DUS4L-BCAP29的功能研究

摘要

嵌合RNA(chimeric RNA/fusion RNA)是由来自不同基因的外显子片段组成的融合转录物.生物信息学分析技术和二代测序技术近年来迅速发展,它们具有精确度高、通量大等优点,被越来越广泛地应用到嵌合RNA的检测中.不断降低的成本更极大促进了转录组中嵌合RNA的挖掘.随着嵌合RNA的广泛性检出,其存在的量大大超出了人们之前的预想,成为转录组学的新热点.嵌合RNA在癌症诊断和治疗中受到关注,一度被认为是肿瘤独有的现象.近两年来,越来越多的嵌合RNA被发现大量存在于非癌组织和细胞中,其中一些也可能在正常生理中起重要作用.从更多的正常组织中挖掘嵌合RNA,将有助于全面理解基因组的构成和功能. 人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUC-MSCs)是来源于人体脐带沃顿胶组织中的多能干细胞,因其具有易于分离培养、高度自我更新能力和多向分化潜能等特点,被作为新型的细胞移植和组织工程的种子细胞,越来越多地应用于再生医学研究领域.但体内研究发现移植的MSCs只有很小一部分可分化为神经元细胞,因此在移植之前需要首先提高MSCs的神经分化能力和功能性神经细胞的分化效率.多能状态下,细胞的转录和表观遗传情况与成体细胞有很大的差别.这种多能干细胞特有的基因表达状态是受多能性相关转录因子和其他调节因子共同调控的.因此,寻找调控hUC-MSCs向神经元样细胞分化的关键因子、探讨hUC-MSCs在体内外微环境诱导下的神经分化机制,是提高hUC-MSCs转归效率和hUC-MSCs临床治疗效果的关键问题.目前的调控因子研究主要集中在小分子化合物、表观遗传学层面、RNA领域中的miRNA和IncRNA.但关于嵌合RNA在hUC-MSCs的增殖和向神经元样细胞分化中的作用,目前尚未见明确报道. 目的： 探索脑组织有关的嵌合RNA,全景式分析其嵌合RNA的特征,并挖掘神经分化有关的关键嵌合RNA;明确神经诱导微环境下关键嵌合RNA对hUC-MSCs的增殖和神经分化能力的影响,并初步探讨其诱导分化机制,在融合基因组层面提供成体干细胞分化的新思路和理论依据. 方法： 1、婴幼儿脑组织背外侧前额叶皮层(DLPFC)中嵌合RNA的挖掘和鉴定 鉴于没有公开的hUC-MSCs及其神经分化的RNA-seq数据,为发现hUC-MSCs在神经分化过程中的关键嵌合RNA,本研究选择了时空上与人体脐带最接近的婴幼儿脑组织DLPFC的RNA-seq数据,利用SOAPfuse软件对婴幼儿脑组织嵌合RNA进行了挖掘、鉴定,全景式分析其嵌合RNA的特征,包括在染色体上的分布情况及数量,类型,母基因功能聚类;接着对22个由相同转录方向的相邻两个基因的外显子构成并且in frame-shift的嵌合RNA在hUC-MSCs及其神经分化的细胞中进行RT-PCR和Sanger法测序的验证,并分析其拼接方式,表达量与母基因的关系,母基因间距,并对嵌合RNA上游母基因倒数第二个外显子及下游母基因第二个外显子附近进行剪接位点预测,对母基因间的区域进行CTCF结合位点预测;对DUS4L-BCAP29进行发生层面的鉴定和形成机制的初步研究:抽提hUC-MSCs细胞基因组DNA,扩增DUS4L-BCAP29片段;抽提hUC-MSCs细胞总RNA,用DNase清除RNA中的基因组污染,以下游母基因的倒数第二个exon的反向引物为特异性引物做逆转录,设计引物扩增横跨5'母基因最后一个exon和intron之间的片段,同时设立不加逆转录酶的阴性对照. 2、DUS4L-BCAP29在正常组织、正常细胞中的表达和功能 在前期分析中发现了高频重复表达的嵌合RNA DUS4L-BCAP29,并且该嵌合RNA在神经分化的hUC-MSCs中高表达.但DUS4L-BCAP29之前被文献报道为前列腺癌、胃癌相关的嵌合RNA.为全面了解DUS4L-BCAP29的功能,首先对DUS4L-BCAP29在人的多个正常组织、正常细胞系及人正常前列腺上皮细胞RWPE-1、人胃粘膜细胞GES-1,18对前列腺癌临床标本及癌旁组织、21对胃癌临床标本及癌旁组织中表达情况进行检测.利用针对DUS4L-BCAP29的siRNA和过表达实验检测DUS4L-BCAP29是否影响RWPE-1和GES-1的增殖和迁移.将转染siDUS4L和siDUS4L-BCAP29的GES-1细胞RNA利用人类表达谱芯片HumanHT-12v4Expression BeadChip检测相关基因变化. 3、慢病毒介导的DUS4L-BCAP29过表达对h UC-MSCs的影响 构建稳定的过表达DUS4L-BCAP29慢病毒感染hUC-MSCs细胞株,CCK-8法和EdU染色法检测hUC-MSCs细胞增殖;PI染色结合流式细胞仪术检测细胞周期;Western Blot检测凋亡蛋白.利用Flag标签,Western Blot检测过表达DUS4L-BCAP29细胞中DUS4L-BCAP29表达产物. 实验分为hUC-MSCs空病毒对照组(CON)和DUS4L-BCAP29过表达组(LV-DUS4L-BCAP29).两组细胞神经分化后,细胞免疫荧光法检测神经标记物DCX、NSE的表达;qRT-PCR检测神经转录因子Ngn1、Ngn2、Mash1的表达.对两组细胞及DUS4L-BCAP29过表达组神经分化后的细胞利用Western Blot检测磷酸化p38MAPK和磷酸化STAT3的表达情况. 结果： 1、婴幼儿脑组织DLPFC中存在丰富的嵌合RNA (1)9个婴幼儿脑组织DLPFC样本共分析出599个嵌合RNA.每个染色体上都有嵌合RNA的存在,1号染色体数量最多,有72个,18号染色体数量最少,只有3个.嵌合RNA的数量跟该染色体本身的基因数量是相关的(R=0.8357,P<0.0001). (2)形成嵌合RNA的上游母基因功能主要集中在蛋白质聚合作用,翻译后的蛋白质折叠.下游母基因功能主要与小分子及蛋白质代谢途径,谷氨酸盐分泌等相关. (3)根据其母基因的染色体位置对嵌合RNA进行分类:INTERCHR,INTRACHR-SS-0GAP,INTRACHR-OTHER.本研究中三种类型的嵌合RNA比例分别为46%,51%,3%.根据相对于母基因外显子的连接位置对嵌合RNA进行分类:E/E,E/M或M/E,M/M.本研究中三种类型的比例分别36%,21%,43%.根据蛋白质编码潜力对嵌合RNA进行分类为:in frame-shift,frame-shift,both,NA.本研究中四种类型的比例分别15%,21%,1%,63%. (4)在hUC-MSCs及其神经分化的细胞中对22个由相邻两个基因的外显子构成并且in frame-shift的嵌合RNA进行验证,有10个嵌合RNA测序结果与软件预测结果相符.其中9个嵌合RNA的组成方式都是包括了上游母基因第一个外显子到倒数第二个外显子及下游母基因第二个外显子到最后一个外显子.这些嵌合RNA母基因的间距均小于基因组平均相邻基因间距值54Kb.生物信息学预测发现这些嵌合RNA上游母基因倒数第二个外显子及下游母基因第二个外显子附近的确有可变剪接位点存在,每个嵌合RNA的母基因间区域至少有一个CTCF可能的结合位点. (5)qRT-PCR发现嵌合RNA DUS4L-BCAP29在神经分化的hUC-MSCs中高表达(P<0.05),且母基因DUS4L表达水平无明显变化.RT-PCR可以从基因间区域检测到转录物.这些结果表明,DUS4L-BCAP29可能与神经分化相关,是通读以后相邻基因顺式剪接的产物. 2、DUS4L-BCAP29在正常组织、正常细胞中广泛表达,并参与细胞的增殖等功能 (1)DUS4L-BCAP29在人的多个正常组织、细胞及人正常前列腺上皮细胞RWPE-1、人胃粘膜细胞GES-1中均有表达,且在18对前列腺癌临床标本及癌旁组织、21对胃癌临床标本及癌旁组织中表达差异无统计学意义. (2)针对DUS4L-BCAP29的siRNA和过表达实验也证实了DUS4L-BCAP29能够影响RWPE-1和GES-1的增殖(P<0.05)和GES-1的迁移(P<0.05).基因芯片结果显示,干扰DUS4L-BCAP29与干扰母基因DUS4L相比,有独特的基因变化. 结论： 1.挖掘出婴幼儿脑组织样本中的599个嵌合RNA,INTRACHR-SS-0GAP类型嵌合RNA稍占优势比例;鉴定正确的10个嵌合RNA几乎均为上游母基因第一个到倒数第二个外显子和下游母基因第二个到最后一个外显子拼接而成;神经分化以后高表达的嵌合RNA DUS4L-BCAP29可能为通读后相邻基因顺式剪接的产物. 2.DUS4L-BCAP29在正常组织、正常细胞中广泛表达.DUS4L-BCAP29不适合作为胃癌和前列腺癌的肿瘤标志物. 3.DUS4L-BCAP29能促进hUC-MSCs细胞的增殖,S期细胞比例增加,抗凋亡能力增强.DUS4L-BCAP29可能以non-coding RNA的形式发挥作用.DUS4L-BCAP29能有效促进hUC-MSCs向神经元样细胞分化.该过程可能与DUS4L-BCAP29抑制磷酸化STAT3蛋白表达有关.

目录

声明

缩略词

引言

第一章 婴幼儿脑组织中嵌合RNA的挖掘和鉴定

前言

1 材料与方法

1.1 主要仪器

1.2 主要试剂试剂

1.3 婴幼儿脑组织DLPFC RNA-Seq数据收集

1.4 婴幼儿脑组织DLPFC嵌合RNA的挖掘和过滤

1.5 婴幼儿脑组织DLPFC嵌合RNA的特征解析

1.6 脐带组织标本的获取

1.7h UC-MSCs的分离、培养

1.8h UC-MSCs的复苏、冻存

1.9 hUC-MSCs细胞表面抗原检测

1.10 hUC-MSCs 细胞神经定向分化

1.11 跨融合位点的上下游引物的设计

1.12 qRT-PCR

1.13 免疫荧光

1.14 琼脂糖凝胶DNA电泳及胶回收、测序

1.15 应用FPKM方法计算序列基因表达水平

1.16 基因间转录本的检测

1.17 CTCF结合位点预测

1.18 可变剪接位点预测

1.19 统计学分析

2 结果

2.1 婴幼儿脑组织RNA-Seq数据中嵌合RNA的挖掘

2.2 hUC-MSCs形态学特点及表面标记物的鉴定

2.3 hUC-MSCs神经定向分化的鉴定

2.4嵌合RNA在h UC-MSC细胞及神经分化细胞中的表达及特点分析

2.5 DUS4L-BCAP29形成机制初步研究

3 讨论

4 小结

第二章 DUS4L-BCAP29在正常组织、正常细胞中的表达和功能

前言

1 材料与方法

1.1 主要试剂

1.2 组织的收集

1.3 细胞培养

1.4 siRNA干扰实验

1.5 过表达DUS4L-BCAP29稳定细胞系的建立

1.6 划痕实验

1.7 基因芯片检测

1.8 统计学分析

2 结果

2.1 DUS4L-BCAP29在人正常组织和细胞的表达

2.2 DUS4L-BCAP29 在人正常前列腺上皮细胞 RWPE-1、人胃粘膜细胞GES-1及前列腺癌细胞系、胃癌细胞系中的表达

2.3 DUS4L-BCAP29 在前列腺癌临床标本及癌旁组织、胃癌临床标本及癌旁组织中的表达

2.4 siRNA干扰效果的检测

2.5 干扰DUS4L-BCAP29或DUS4L对RWPE-1、GES-1细胞迁移的影响

2.6 基因芯片结果

2.7 过表达DUS4L-BCAP29稳定细胞系的建立

2.8 过表达DUS4L-BCAP29对RWPE-1、GES-1细胞增殖和迁移的影响

3 讨论

4 小结

第三章 慢病毒介导的DUS4L-BCAP29 过表达对hUC-MSCs 的影响

前言

1 材料与方法

1.1 主要试剂

1.2 慢病毒介导的过表达 DUS4L-BCAP29 的 hUC-MSCs 稳定细胞系的构建

1.3 CCK-8 实验

1.4 EdU法检测细胞增殖情况

1.5 PI 染色检测细胞周期情况

1.6 hUC-MSCs 细胞的成神经分化

1.7 qRT-PCR

1.8 细胞免疫荧光

1.9Western blot

1.10 统计学分析

2 结果

2.1 慢病毒介导的过表达 DUS4L-BCAP29 的 hUC-MSCs 稳转细胞系的构建

2.2 过表达DUS4L-BCAP29 对hUC-MSCs细胞增殖的影响

2.3过表达DUS4L-BCAP29对h UC-MSC细胞周期的影响

2.4过表达DUS4L-BCAP29对h UC-MSC细胞凋亡的影响

2.5Western blot检测DUS4L-BCAP29基因产物

2.6 过表达DUS4L-BCAP29影响 hUC-MSCs 向神经分化的情况

2.7 过表达DUS4L-BCAP29对 hUC-MSCs信号通道的影响

3 讨论

4 小结

全文结论

下一步工作计划

参考文献

综述:嵌合RNA在正常组织和肿瘤中的研究进展

参考文献

个人简历及博士期间发表的学术论文

致谢