云芝产漆酶的发酵条件、分离纯化及特性研究

摘要

漆酶(LaccaseEC1.10.3.2)是一种含铜的多酚氧化酶，1883年首次从漆树漆液中被发现，随后发现广泛存在于自然界中。已发现植物、真菌、昆虫以及细菌能产生这类酶，其中最重要的生产者是担子菌中的白腐菌。漆酶可催化酚类化合物和芳香胺的氧化，而且在还原介体物质存在下，漆酶的底物范围可进一步地扩大。100多年来，漆酶一直是生物学、化学和环境科学等领域十分活跃的研究热点，其中最受重视的是漆酶在木质素降解中的重要效用。随着研究的深入，漆酶在含酚废水的处理、环境中酚类毒物的降解、饮料加工、食用药用菌生产、饲料工业、医药卫生等方面的应用日渐普及。漆酶的研究涉及生物、化学、物理、医学、食品、环境等多个学科，所以对漆酶进行深入系统研究不仅具有极大的理论价值，而且也会产生巨大的社会和经济效益。本文主要从以下几个方面进行概述和研究： 1、主要概述了木质素降解酶系中漆酶的研究进展。对木质素降解微生物、酶类进行了分类说明，尤其对漆酶的生化特性、分子结构、反应机理及其分子生物学研究现状进行了系统的综述，最后对漆酶的应用进行全面阐述； 2、首先确认云芝漆酶为分泌型胞外酶，考察了产酶与生物量之间的关系，确定产酶高峰期。然后对不同的碳源、氮源、初始pH、接种量、装液量、表面活性剂、诱导剂与云芝发酵产酶量进行单因素比较，继而设计正交试验，确定最佳的发酵产酶条件，同时考察各因素主效应与产酶的显著差异。试验结果表明：葡萄糖7.5g/L、酵母粉6g/L、吐温-800.2％(V/V)、CuSO4·5H2O浓度0.05mmol/L、愈创木酚2‰(g/L)、初始pH4.5、250ml三角瓶中装液体培养基100ml时，为最佳发酵培养条件，酶活力显著提高。初始pH对产酶的影响达到极显著水平，酵母粉、吐温-80对产酶的影响均达到显著水平； 3、主要研究了云芝漆酶的分离、纯化及鉴定。首先确认粗酶液至少含有两型漆酶同工酶LacA、LacB。粗酶液在80％(NH4)2SO4盐析后，经DEAESepharoseFastFlow层析柱、Sephadex-G100柱层析两步层析，得到电泳纯组分LacA、LacB，得率分别为10.42％、13.91％，分子量分别为65KD、59KD。对两个组分利用特异反应，原子吸收光谱，蛋白质N端序列的测定进行鉴定，结果证实这两种组分应属于漆酶家族，肽指纹图谱的分析结果也支持这一结论； 4、主要研究了pH值、金属离子、温度对云芝漆酶LacA和LacB反应速率和稳定性的影响，以及酶底物的浓度效应和Km值。实验结果表明：Cu2+、Co2+对LacA和LacB有激活作用，而Ag+则有抑制作用；LacA、LacB反应最适pH为4.0和4.8，LacA在pH3.6～4.8，LacB在pH4.0～5.2表现较好的稳定性；LacA和LacB的最适反应温度分别为50℃和40℃；LacA和LacB的Km值分别为0.32×10-3mol/L、0.139×10-3mol/L；5、主要是云芝漆酶与纤维素酶、木聚糖酶的协同作用对提高木质纤维素利用效率的研究，及云芝发酵粗酶液、漆酶LacA和LacB对不同分子结构类型的多种染料脱色的探讨。漆酶的应用提高木质纤维素降解率，发酵粗酶液具有广谱脱色作用，尤其对孔雀石绿、RB亮蓝的脱色率都超过了85％，脱色较为彻底。漆酶LacA和LacB对三苯甲烷类染料亮绿、孔雀石绿脱色率都超过了90％，而两种漆酶之间在脱色程度上表现出一定的差异。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略语表

第一章文献综述

第二章云芝产漆酶的发酵条件研究

第三章云芝漆酶的分离、纯化及鉴定

第四章云芝漆酶理化性质及动力学研究

第五章云芝漆酶的应用初探

后记和展望

参考文献

致谢

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