黄粉甲抗冻蛋白AFP84a定点突变的研究

摘要

昆虫抗冻蛋白具有较高的抗冻活性，生物体内微量的抗冻蛋白尤其是高活性的抗冻蛋白很难满足诸多方面应用。因此，探索出生产高活性抗冻蛋白的有效方法亟待解决。本研究基于此目的利用基因工程的技术和方法开展了抗冻蛋白基因的分子克隆、突变和表达工作。通过在引物上设计突变位点A和B，运用PCR技术扩增和克隆出了融合克隆载体pUCm-T-afp84a的突变体pLICm-T-afp84a-A和pUCm-T-afp84a-B。两个突变体与载体pMAL-c2X双酶切后连接，构建融合表达质粒pMAL-c2X-afp84a-A和pMAL-c2X-afp84a-B。2个表达质粒分别转化Ecoli TBI。经IPTG及最适条件诱导表达，目的蛋白表现为可溶性。超声波细胞破碎法使2种融合蛋白分别从含有融合表达质粒的细胞中释放。融合蛋白运用亲和层析和分子筛层析纯化后，SDS-PAGE显示目的蛋白呈单一条带；生物活性实验检测各自目的蛋白具有一定的抗冻活性。对比结果，突变后的抗冻蛋白都具有比突变前较高的抗冻活性，为进一步研究提高抗动蛋白活性摸索了一个有效的办法。

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文摘

英文文摘

论文说明：缩略语表

声明

1前言

1.1抗冻蛋白的分类

1.1.1鱼类抗冻蛋白

1.1.2植物抗冻蛋白

1.1.3昆虫抗冻蛋白

1.2黄粉甲抗冻蛋白的研究

1.2.1黄粉甲抗冻蛋白的种类与含量

1.2.2黄粉甲抗冻蛋白的结构特点

1.2.3黄粉甲抗冻蛋白功能研究

1.2.4黄粉甲抗冻蛋白作用机制的研究

1.2.5黄粉甲抗冻蛋白的基因及基因工程研究

1.3抗冻蛋白的应用研究

1.3.1在农业中的应用

1.3.2在食品工业中的应用

1.3.3在医学上的应用

1.3.4在鱼类上的应用

1.3.5在工业上的应用

1.4外源基因在大肠杆菌中表达的研究

1.4.1非融合表达载体

1.4.2融合表达载体

1.5本课题的立题依据、重要意义及研究方法

1.5.1立题依据和重要意义

1.5.2研究方法

2材料和方法

2.1实验材料

2.1.1主要仪器设备

2.1.2主要试剂

2.1.3溶液配方和配制

2.1.4质粒和宿主菌

2.1.5引物设计

2.2实验方法

2.2.1突变融合克隆载体的构建

2.2.2阳性克隆的鉴定

2.2.3突变融合表达载体pMAL-c2X-afp84a-A和pMAL-c2X-afp84a-B的构建

2.2.4重组质粒的转化

2.2.5突变融合表达载体的鉴定

2.2.6目的蛋白的诱导表达和纯化

2.2.7表达产物的SDS-PAGE电泳检测

2.2.8蛋白活性检测

3结果

3.1抗冻蛋白基因融合表达载体pMAL-c2X-afp84a-A和pMAL-c2X-afp84a-B的构建

3.1.1以突变引物PCR扩增出pUCm-T-afp84a-A和pUCm-T-afp84a-B

3.1.2克隆重组质粒pUCm-T-afp84a-A和pUCm-T-afp84a-B的测序鉴定

3.1.3表达重组质粒pMAL-c2X-afp84a-A和pMAL-c2X-afp84a-B的质粒PCR和双酶切鉴定

3.2黄粉甲抗冻蛋白AFP84a-A和AFP84a-B的诱导表达与纯化

3.2.1细胞质中融合蛋白的诱导与纯化

3.2.2融合蛋白纯化后的切割

3.2.3切割后的融合蛋白的二次过柱纯化

3.2.4二次过柱后的Sephacryl-S 100 HR柱层析(凝胶过滤层析)

3.2.5目的蛋白的纯度检测

3.3黄粉甲抗冻蛋白抗冻活性检测

4 讨论

4.1表达载体的选择

4.2抗冻蛋白的定点突变

4.3 MBP/目的蛋白的纯化

4.4目的蛋白的活性检测

5结论

参考文献

致谢