库普弗细胞的药物、毒物及其它化学物反应相关基因与大鼠肝再生的相关性研究

摘要

库普弗细胞(Kupffer cells，KC)是肝内固有的巨噬细胞，承担着多种重要功能。在肝再生中，库普弗细胞的形态及生理生化活动变化很大，其在肝再生中的作用很值得研究。 为了探寻库普弗细胞的药物、毒物及其它化学物反应相关基因与大鼠肝再生的相关性，本研究按Higgins等方法制作大鼠2/3肝切除模型，用门静脉两步灌流法分散肝脏细胞，用Percoll梯度离心和免疫磁珠分选法分离库普弗细胞，用免疫化学方法对其进行鉴定，用蛋白免疫印迹方法检测库普弗细胞的标志蛋白溶菌酶(lysozyme，LYZ)和外胚层发育不良抗原-2(ectodermal dysplasia2，ED2)，用荧光定量PCR测定上述两者的mRNA含量。结果显示，分离的库普弗细胞中，溶菌酶和外胚层发育不良抗原-2阳性细胞占96％以上：部分肝切除后各恢复时间点库普弗细胞的上述蛋白含量稳定，相应的mRNA含量亦稳定。 本研究用搜索网站数据库和查阅相关学术论文等方法获得对药物、毒物及其它化学物的反应基因及其参与的生理生化活动，用大鼠2302.0全基因组表达谱芯片检测了大鼠部分肝切除(partial hepatectomy，PH)组与手术对照(operation control，OC)组在部分肝切除后恢复0、2、6、12、24、30、36、72、120、168h等10个时点的库普弗细胞的基因表达情况，用系统生物学方法分析了它们的活动和作用。初步证实，库普弗细胞在部分肝切除后迅速激活，并合成肿瘤坏死因子、肝细胞生长因子、表皮生长因子、一氧化氮、转化生长因子等多种细胞因子。除导致自身形态、功能发生改变外，还直接影响邻近的多种细胞，参与肝再生启动和进展。 研究表明，库普弗细胞的药物、毒物及其它化学物反应相关基因中共137个与肝再生相关，涉及细胞代谢、增殖、分化、免疫等多种生理活动：在肝再生启动(PH后2-6h)、进展(PH后6-72h)和终止(PH后72-168h)等三个阶段，起始表达的基因数分别为：69，48和16，总表达的基因数分别为：69，106和83，表明相关基因主要在肝再生启动阶段起始表达，在不同阶段发挥作用，并贯穿于整个肝再生；它们中55％的基因表达增强，45％的基因表达减弱，表明肝再生中库普弗细胞的多数药物、毒物及其它化学物反应基因表达增强，少数基因表达降低；它们的上调范围为对照的3-76.66倍，下调范围为对照的3-133.46倍，表达模式分为13种，表明肝再生中库普弗细胞的生理生化活动多样、复杂。 根据上述基因在肝再生中的表达变化推测，部分肝切除后库普弗细胞迅速激活，并通过释放各种细胞因子启动肝再生；其药物和毒物反应减弱，防止肿瘤、毒物和自身免疫反应；其参与物质运输、细胞增殖和分化、信号传递以及结构重建等活动的基因表达增强，促进自身及肝细胞、血管内皮细胞等增殖。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略语表

声明

第1章文献综述

1.1肝再生研究概况

1.2肝再生动物模型

1.3库普弗细胞

1.3.1库普弗细胞的形态结构和生理功能

1.3.2库普弗细胞与大鼠肝再生

1.4库普弗细胞的分离纯化

1.4.1肝脏细胞的分散

1.4.2库普弗细胞的分离

1.5应激反应与肝再生

1.6本论文的研究目的及意义

1.6.1研究目的和目标

1.6.2理论意义和应用前景

参考文献

第2章材料和方法

2.1实验动物

2.2大鼠2／3肝切除模型的构建

2.3再生肝库普弗细胞的制备

2.3.1工作液配制

2.3.2肝脏细胞分散

2.3.3库普弗细胞的分离和纯化

2.4再生肝库普弗细胞的免疫化学

2.4.1工作液配制

2.4.2防脱载玻片制作

2.4.3细胞涂片制作

2.4.4染色

2.5再生肝组织的免疫化学

2.5.1取材固定

2.5.2石蜡切片制作

2.5.3染色

2.6蛋白浓度测定

2.6.1溶液配制

2.6.2实验步骤

2.7聚丙烯酰胺凝胶电泳

2.7.1溶液配制

2.7.2实验步骤

2.8蛋白免疫印迹

2.8.1溶液配制

2.8.2实验步骤

2.9总RNA提取与纯化

2.9.1总RNA提取

2.9.2总RNA的定量和质检

2.9.3总RNA纯化

2.9.4纯化RNA的定量和质检

2.10 cDNA的合成和纯化

2.10.1 cDNA的合成

2.10.2 cDNA纯化

2.11 cRNA的合成、纯化和片段化

2.11.1 IVT合成cRNA

2.11.2 cRNA的纯化

2.11.3 cRNA的定量和质检

2.11.4 cRNA的片段化

2.12芯片杂交、洗脱和扫描

2.12.1杂交液配制

2.12.2杂交液预处理

2.12.3芯片预杂交

2.12.4芯片杂交

2.12.5芯片洗脱和扫描

2.12.6芯片检测数据的获取与处理

2.13药物、毒物及其它化学物反应基因中肝再生相关基因的确认

2.13.1药物、毒物及其它化学物反应基因的确认

2.13.2肝再生相关基因的鉴定

2.14荧光定量PCR

2.14.1引物设计与合成

2.14.2总RNA提取及DNA消化

2.14.3 RNA反转录

2.14.4标准曲线制备

2.14.5 mRNA定量

2.15 Rat Genome 230 2.0芯片检测结果的可靠性分析

参考文献

第3章实验结果

3.1大鼠肝再生中库普弗细胞的鉴定及形态变化

3.2大鼠肝再生中库普弗细胞的标志蛋白及其基因的表达情况

3.3 Rat Genome 230 2.0芯片的杂交和扫描

3.3.1总RNA的提取和纯化

3.3.2芯片的杂交和扫描

3.4荧光定量PCR检测目的基因在肝再生中表达变化

3.4.1目的基因的重复性和内参基因的标准曲线

3.4.2荧光定量PCR检测结果与表达谱芯片检测结果比较

3.5库普弗细胞的药物、毒物及其它化学物反应基因在肝再生中的表达变化

3.5.1再生肝库普弗细胞的药物、毒物及其它化学物反应基因的表达变化

3.5.2再生肝库普弗细胞的药物、毒物及其它化学物反应基因的表达模式

3.5.3再生肝库普弗细胞的药物、毒物及其它化学物反应基因的互作关系

参考文献

第4章讨论

4.1肝脏的灌注与消化

4.2库普弗细胞的分离与纯化

4.3药物、毒物及其它化学物反应基因与肝再生的相关性

4.4库普弗细胞与肝再生的相关性

4.5问题与展望

参考文献

第5章总结与结论

5.1总结

5.2结论

致谢

攻读硕士学位期间参加的科研项目和已发表及待发表的论文