Kruppel样因子4基因klf4在大鼠肝再生中作用研究

摘要

klf4作为诱导iPS细胞的转录因子已成为研究领域的热点，其在调控细胞增殖、分化、胚胎发育等生命过程中均发挥重要作用。
　　 为了探讨klf4过量或降低表达对肝脏再生的作用，本文以大鼠再生肝为材料，参照klf4的mRNA序列信息设计克隆引物和带酶切位点引物，采用分子克隆技术得到klf4的克隆载体，测序证实正确后，以其为模板，进一步将基因克隆到真核表达载体pEGFP-N1上，构建出表达载体pEGFP-N1-klf4;另外，同样参照klf4的mRNA序列信息，利用锐博、Genesil、Ambion和QIAGEN等网站的在线设计工具，查阅siRNA设计相关论文，针对klf4mRNA的2个区域合成寡聚核苷酸片段连接到干涉载体pGenesil-1.0上，构建出2个干涉klf4mRNA的干涉载体pGenesil-1.0-k814和pGenesil-1.0-k1082;同样，双酶切表达载体pEGFP-N1-klf4得到klf4的ORF，将其连接到干涉载体pGenesil-1.0-k814和pGenesil-1.0-k1082上，构建出干涉载体对应的检验载体pGenesil-1.0-k814-klf4和pGenesil-1.0-k1082-klf4。测序证实正确后，将klf4构建到干涉载体中，完成干涉载体对应检验载体pGenesil-1.0-k814-klf4和pGenesil-1.0-k1082-klf4的构建；利用构建的klf4的表达载体、干涉载体和检验载体，采用尾静脉液压转基因法，分别将构建的3组载体注入大鼠体内，荧光显微技术、统计学方法和常规组织学技术检测转klf4后大鼠死亡率、肝指数和肝组织形态结构的变化。
　　 经测序和电泳检测证实，本论文成功构建了klf4的表达载体、干涉载体和检验载体。运用尾静脉液压转基因法进行klf4基因添加或RNA干涉研究klf4在大鼠肝再生中作用发现，目的质粒的肝内表达动力学与载体作用检测结果一致，说明目的片段成功表达。转入pEGFP-N1-klf4质粒后大鼠死亡率正常，肝指数在120h略有升高，肝组织的显微结构无明显变化。转入pGenesil-1.0-k814、pGenesil-1.0-k1082质粒后，大鼠死亡率明显高于正常范围，肝指数在120h略有上升、168h略有下降，肝组织的显微结构无明显变化。本文克隆了klf4基因，构建其表达载体、干涉载体和检验载体，根据体内检测结果初步判断klf4与大鼠肝脏再生有关。本文积累的研究经验与数据将为今后对klf4与肝再生的进一步研究提供重要的参考和指导。

目录

文摘

英文文摘

缩略语表

第一章 文献综述

1. 肝再生的研究进展

1.1 肝再生模型

1.2 肝再生机理

1.3 大鼠肝再生过程

2. klf4研究进展

2.1 klf家族

2.2 klf4的结构

2.3 klf4的作用

2.4 klf4与细胞生长、分化

2.5 klf4与癌症

2.6 klf4与iPS细胞

3. 本论文的目的和意义

3.1 研究目的

3.2 研究意义

3.3 研究方案

第二章 klf4在大鼠肝再生中作用研究

1. 引言

2. 材料与方法

2.1 主要试剂与仪器

2.2 实验动物

2.3 大鼠部分肝切除(PH)模型制作

2.4 klf4的基因克隆

2.5 klf4的干涉片段制备

2.6 klf4的表达载体pEGFP-N1-klf4构建

2.7 klf4的干涉载体pGenesil-1.0-k814及pGenesil-1.0-k1082构建

2.8 klf4的检验载体pGenesil-1.0-k814-klf4、-k1082-klf4及HK-klf4构建

2.9 质粒的大量提取

2.10 大鼠肝脏的液压转基因

2.11 转klf4后大鼠死亡率检测

2.12 转klf4后大鼠肝组织的显微结构观察

2.13 klf4在大鼠再生肝内的表达动力学检测

2.14 转klf4后大鼠肝再生情况检测

3. 结果

3.1 克隆klf4

3.2 制备klf4的干涉片段

3.3 构建的表达载体pEGFP-N1-klf4及结构

3.4 构建的干涉载体pGenesil-1.0-k814及pGenesil-1.0-k1082的结构

3.5 构建的检验载体pGenesil-1.0-k814-klf4、-k1082-klf4和HK-klf4及结构

3.6 转klf4后大鼠死亡率

3.7 转klf4后大鼠肝组织结构变化

3.8 klf4在大鼠肝内的表达动力学

3.9 转klf4对大鼠肝再生的影响

4. 讨论

4.1 克隆klf4基因和构建各种载体的最佳条件

4.2 大鼠肝脏液压转基因方法的优缺点

4.3 klf4在大鼠肝再生中作用及机理

总结

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间参加的科研项目和已发表的论文