两种泥鳅中FTZ-F1基因的克隆、表达和选择性剪切分析

摘要

FTZ-F1(the fushitarazu factor-l)基因属于核受体超家族成员，最初是在果蝇中发现的，该基因作为转录因子能够激活果蝇早期胚胎形成阶段体节分化基因fushi-tarazu(ftz)的表达。目前已经发现了很多它的同源性基因。研究表明它在类固醇的生成和性别分化过程中发挥着重要的作用。鱼类在脊椎动物的进化系统中处于承前启后的地位，是脊椎动物中分布最广、种类最多的类群，具有着多种多样的生物学特征和重大的经济价值。因而，对鱼类的FTZ-F1基因进行研究，不仅有助于了解FTZ-F1基因的结构和功能作用，更有助于揭示鱼类中性别决定和分化的机制，进而为阐明脊椎动物的性别决定与分化体系的进化历程提供理论依据。
　　 本研究采用同源克隆策略和RACE技术，从两种泥鳅的精巢中分离得到了FTZ-F1的cDNA全长序列，且获得了如下结果:
　　 1、泥鳅FTZ-F1有两种亚型即Maffa-Ⅰ和Maffa-Ⅱ,泥鳅的Maffa-Ⅰ的cDNA全长为1903bp，Maffa-Ⅱ的为2020bp，其3’非翻译区长均为278bp(包括poly(A))，开放阅读框长也均为1455bp，编码484个氨基酸，而Maffa-Ⅰ的5’-UTR长为170bp，Maffa-Ⅱ的5’-UTR长为287bp。
　　 2、大鳞副泥鳅的FTZ-F1基因有六种不同的亚型，分别命名为Pdffa-IA(2308bp)，Pdffa-IB(174lbp),Pdffa-IB,(1507bp),Pdffa-IIA(2609bp),Pdffa-IIB(2042bp)和Pdffa-IIB’(1808bp)。因5'端的转录起始位点和3’端选择性剪切形式的不同，这六种不同的FTZ-F1亚型能够编码4种转录本，Pdffa-IA开放阅读框长为1455bp，编码484个氨基酸:Pdffa-IIA开放阅读框长为155lbp，编码516个氨基酸，Pdffa-IB和Pdffa-IB’的开放阅读框为1170bp，编码389个氨基酸，Pdffa-IIB和Pdffa-IIB'的开放阅读框为1266bp，编码421个氨基酸。
　　 3、序列分析表明两种泥鳅的FTZ-FI基因具有着孤儿核受体家族的典型结构，且具有FTZ-F1家族特有的FTZ-FI盒。系统进化分析表明两种泥鳅的FTZ-F1基因属于FTZ-F1家族的NR5A2亚族，与斑马鱼的ffla的同源性最高，这说明FTZ-F1墓因在长期进化中相对保守。
　　 4、采用半定量RT-PCR和荧光实时定量RT-PCR的方法检测两种泥鳅FTZ-F1基因在雌性和雄性成体的不同组织和胚胎发育过程中的表达特征，结果显示:两种泥鳅的FTZ-F1基因在各组织中广泛分布，且在雄性个体各组织中的表达量均比在雌性个体中的高，并在性腺组织中和雄性的肝脏中都表达较为强烈，在心脏中的表达最弱。这表明两种泥鳅的FTZ-F1基因组织表达既具有LRH-1/FTF亚族的特征也具有.SF-1/Ad4BP亚族的特征，且推测两种泥鳅的FTZ-F1基因与雄性性腺的分化和发育具有明显的相关性。在胚胎发育中，泥鳅的Maffal和Maffall在各发育时期都有表达，Maffal在神经胚期和孵出期的表达较强，而Maffall却呈现出逐渐下降的趋势。这说明泥鳅的FTZ-FI基因可能参与器官的发育过程。
　　 基因的选择性剪切，在果蝇、线虫等低等动物的性别分化过程中起着十分重要的作用。FTZ-F1基因是脊椎动物性腺分化过程中一个非常重要的基因，其选择性剪切的发现，有可能为揭示鱼类性腺发育的机制提供一个新的视角。

目录

摘要

1 前言

1．1 鱼类的性别决定机制

1．1．1 鱼类的性别决定类型

1．1．2 鱼类性别决定相关基因的研究

1．2 孤儿核受体FTZ-F1

1．2．1 核受体超家族研究概况

1．2．2 FTZ-F1基因(或NR5A亚家族)的发现

1．2．3 FTZ-F1基因的结构及其功能的研究

1．2．4 鱼类中FTZ-F1基因的研究进展

1．3 本研究的目的、意义和内容

2 材料和方法

2．1 材料

2．1．1 实验动物

2．1．2 宿主菌株和载体

2．1．3 主要试剂

2．1．4 主要仪器设备

2．1．5 引物

2．1．6 溶液和培养基的配制

2．2 方法

2．2．1 总RNA的制备

2．2．2 两种泥鳅FTZ-F1基因保守区序列的克隆、测序及分析

2．2．3 两种泥鳅FTZ-F1基因非保守区的克隆、测序及分析

2．2．4 两种泥鳅FTZ-F1基因cDNA全序列拼接及进化树的构建

2．2．5 两种泥鳅FTZ-F1基因时空特异性表达分析

3 结果与分析

3．1 两种泥鳅FTZ-F1基因cDNA全长的克隆

3．1．1 两种泥鳅精巢总RNA的提取结果

3．1．2 两种泥鳅FTZ-F1基因保守区的克隆

3．1．3 利用RACE法克隆两种泥鳅FTZ-F1基因全序列

3．2 两种泥鳅FTZ-F1基因的序列分析

3．2．1 cDNA全长序列分析

3．2．2 两种泥鳅FTZ-F1基因的选择性剪切模式分析

3．2．3 两种泥鳅FTZ-F1基因同源性和聚类分析

3．3 两种泥鳅FTZ-F1基因表达模式分析

3．3．1 泥鳅中FTZ-F1基因的表达模式分析

3．3．2 大鳞副泥鳅FTZ-F1基因的表达模式分析

4 讨论

4．1 两种泥鳅FTZ-F1基因的结构分析

4．2 两种泥鳅FTZ-F1基因的表达分析与功能预测

4．3 两种泥鳅FTZ-F1基因的选择性剪切

4．4 结语和展望

参考文献

致谢

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