β-甘露聚糖酶内生类芽孢杆菌诱变选育及酶的纯化研究

摘要

内生菌是一类重要的微生物资源，内生菌的存在对植物的生长发育和产量、品质均有明显的影响，内生菌的研究自Vogl在1898年从黑麦草种子内分离出第一株内生真菌，此后植物内生菌作为一种新的微生物资源受到了广泛的关注。类芽孢杆菌是从芽孢杆菌分出的一个新属，目前已有22种。本实验室由刺槐豆中分离出一株具有β-甘露聚糖酶活性的内生菌，本实验室由刺槐豆中分离出一株具有β-甘露聚糖酶活性的内生茵，经初步鉴定为类芽孢杆菌属潜在的一个新种，命名为Paenibacillussp CH-3。本研究将从诱变选育、产酶条件优化、酶的纯化、酶学特性研究及发酵罐放大这几方面对Paenibacillussp CH-3进行研究。
　　 采用紫外诱变，硫酸二乙酯诱变，紫外线.光复活诱变、亚硝酸盐诱变、紫外.亚硝酸盐复合诱变、及紫外，硫酸二乙酯.亚硝酸盐三重复合诱变，对该菌株进行诱变选育，研究发现其最佳诱变方法是先用紫外20W诱变80s，再用1％的硫酸二乙酯处理20min，初筛、复筛筛选出的具有高产酶活性的菌株，对其进行活化培养后用亚硝酸盐诱变处理15min，最终其发酵产酶酶活达可达近150U/mL，较出发菌株产酶酶活提高了200％，其遗传稳定性研究发现此菌株遗传1-5代不太稳定，6代以后其相对酶活趋于稳定，约为出发菌株的2.55倍，并将该菌株命名为Paenibacillussp CH3-5。
　　 通过对Paenibacillussp CH3-5的产酶培养基和发酵条件优化，确定最佳产酶培养基为:魔芋粉3％，酵母膏0.1％，磷酸氢二钾0.2％，硫酸镁0.3％，氯化钠0.1％，磷酸氢二铵0.5％，CaC122mmol/L，pH6.5，121℃灭菌20min，最佳发酵条件为接种量2％，37℃200r/min培养78h后测酶活，此时测得酶活最高为233.5U/mL。
　　 采用硫酸铵盐析、乙醇沉淀、丙酮沉淀和双水相处理对Paenibacillussp CH3-5产的β-甘露聚糖酶进行纯化研究，PEG/(NH4)2SO4萃取在最优体系为PEG20％(m/m)，(NH4)2SO418％(m/m)，NaCl1％(m/m)，酶液30％，水30％时，酶萃取率高达97.22％，其纯化倍数为2.59倍，酶收率最高约为47％;硫酸铵盐析酶收率为16.6％，纯化倍数为1.89倍;乙醇沉淀酶收率最高为14.8％，纯化倍数为0.108倍;丙酮沉淀酶收率最高为23.4％.纯化倍数为0.038倍。
　　 对Paenibacillussp CH3-5产β-甘露聚糖酶进行酶学特性分析，该酶最适反应温度和最适反应pH分别为40℃和7.0，在温度为30-45℃、pH6.0-7.5之间时酶活力较为稳定。
　　 发酵罐放大研究发现，42h时其酶活力最高为186.28U/mL，补料后酶活力有一定上升。Paenibacillussp CH3-5所产的β-甘露聚糖酶酶活范围与动物体内环境相似，因此此酶可以广泛的应用在食品、饲料、保健品等行业。

目录

摘要

缩略词表

第一章 前言

1．1 β-甘露聚糖酶的发现史

1．2 β-甘露聚糖酶的来源及性质

1．3 植物内生菌的研究及作用

1．4 类芽孢杆菌研究

1．4．1 类芽孢杆菌研究进展

1．4．2 类芽孢杆菌的研究应用

1．4．3 类芽孢杆菌与β-1，3-葡聚糖酶

1．4．4 内生类芽孢杆菌研究现状

1．5 β-甘露聚糖酶的纯化研究

1．6 本研究的目的和意义

第二章 产β-甘露聚糖酶CH-3的诱变选育

2．1 原始出发菌株来源及菌悬液和粗酶液的制备

2．1．1 原始出发菌株来源

2．1．2 菌悬液及粗酶液的制备

2．2 主要培养基

2．3 实验用主要试剂及仪器

2．3．1 试验主要用试剂

2．3．2 仪器

2．4 试剂与缓冲液配制

2．4．1 DNS试剂

2．4．2 主要缓冲液

2．5 酶活测定

2．5．1 绘制标准曲线

2．5．2 DNS法测酶活

2．5．3 酶活计算方法

2．6 Paenibacillus sp CH-3菌株的诱变及选育

2．6．1 菌株生长曲线绘制

2．6．2 紫外诱变

2．6．3 硫酸二乙酯诱变

2．6．4 紫外线-光复活诱变

2．6．5 紫外线-硫酸二乙酯诱变

2．6．6 亚硝酸盐诱变及其复合诱变

2．6．7 诱变菌株的初筛和复筛

2．7 诱变菌株遗传稳定性的研究

2．8 诱变选育结果与分析

2．8．1 CH-3菌株生长曲线

2．8．2 紫外诱变结果与分析

2．8．3 硫酸二乙酯诱变结果

2．8．4 紫外线-光复活诱变结果

2．8．5 紫外-硫酸二乙酯复合

2．8．6 亚硝酸盐诱变及紫外亚硝酸钠复合诱变研究

2．8．7 高产突变菌株CH3-5的遗传稳定性研究

2．9 本章小结

第三章 诱变菌株CH3-5发酵产酶条件优化

3．1 诱变菌株来源

3．2 培养基与试剂

3．3 产酶培养基及产酶条件的优化方法

3．3．1 主要碳源对突变菌株发酵产酶的影响

3．3．2 不同氮源对诱变突变菌株发酵产酶的影响

3．3．3 不同碳源与氮源比及有机氮源无机氮源比对发酵产酶的影响

3．3．4 离子及甘氨酸对突变菌株发酵产酶的影响

3．3．5 接种量与发酵时间对突变菌株产酶的影响

3．3．6 pH对突变菌株产酶的影响

3．3．7 培养温度对突变菌株产酶的影响

3．3．8 摇床转速对突变菌株发酵产酶的影响

3．4 结果与分析

3．4．1 主要碳源对CH3-5发酵产酶的影响

3．4．2 氮源对CH3-5发酵产酶的影响

3．4．3 碳源与氮源比及有机氮源与无机氮源比对产酶的影响

3．4．4 离子及甘氨酸对CH3-5发酵产酶的影响

3．4．5 接种量对CH3-5发酵产酶的影响

3．4．6 初始pH对CH3-5发酵产酶的影响

3．4．7 培养温度对发酵产酶的影响

3．4．8 转速对CH3-5发酵产酶的影响

3．5 本章小结

第四章 β-甘露聚糖酶的分离纯化

4．1 主要试验仪器及药品

4．2 蛋白质含量测定

4．3 酶回收率、比活力及纯化倍数的计算

4．4 分离纯化方法

4．4．1 硫酸铵盐析

4．4．2 乙醇沉淀

4．4．3 丙酮沉淀

4．4．4 双水相萃取

4．5 结果与分析

4．5．1 硫酸铵纯化结果

4．5．2 乙醇沉淀结果与分析

4．5．3 丙酮沉淀结果与分析

4．5．4 双水相处理结果与分析

4．6 本章小结

第五章 CH3-5产β-甘露聚糖酶性质与发酵罐放大

5．1 试验菌株来源

5．2 培养基、试剂及仪器

5．3 酶学特性质测定方法与发酵罐放大

5．3．1 温度对酶活及酶稳定性的影响

5．3．2 pH对酶活及酶稳定性的影响

5．3．3 发酵罐放大实验

5．4 产β-甘露聚糖酶菌株CH3-5酶学特性分析

5．4．1 温度对酶活及酶稳定性的影响

5．4．2 pH对酶活及酶稳定性的影响

5．5 发酵罐放大实验

第六章 讨论

6．1 菌株诱变选育探讨

6．2 酶纯化探讨

第七章 结论

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间所发表的论文

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