两种泥鳅再生尾鳍中HSP60和HSP70基因的克隆及其表达分析

摘要

热激蛋白分子(HSPs)是一类具有高度保守性的分子，当机体受到热击等有害刺激时机体为保护自身稳定而表达的一类可诱导蛋白，在损伤蛋白的折叠与修复、细胞保护、抗凋亡以及疾病等方面有重要的作用。HSP60和HSP70是其中非常关键的两个成员，在生物体内发挥多种重要的功能，虽然对其结构和多种生理功能皆有研究，但是在组织再生过程中的作用研究很少，鱼鳍再生中更是寥寥数笔。
　　 本课题以适应性强、营养价值高的黄河泥鳅和大鳞副泥鳅为材料，采用RACE法克隆两种泥鳅再生尾鳍中的HSP60和HSP70全长序列，分析其序列结构;设计含酶切位点的ORF引物，克隆其开放阅读框，与pET-32a构建重组表达质粒，导入BL21表达菌株，诱导其表达重组目的蛋白;设计荧光定量引物，以GAPDH为内参基因，采用相对荧光Real-timePCR法分析两种泥鳅尾鳍再生过程中HSP60和HSP70的表达模式。
　　 用RACE法获得了两种泥鳅的HSP60和HSP70的全长序列，两种泥鳅HSP60基因ORF均为1728bp，推测编码576个氨基酸，分子量为61.051kD，理论等电点为4.75，其序列中含有HSP60家族中的GGM重复序列和AAVEEGIVPGGG标签序列，同源度和进化分析发现HSP60序列高度保守;两种泥鳅HSP70基因ORF均为1932bp，推测编码644个氨基酸，分子量为70.397kD，理论等电点为4.38，其序列中含有HSP70家族中的胞质标签EEVD及3个HSP70家族标签序列(分别是IDLGTTYS、IFDLGGGTFDVSIL以及IVLVGGSTRIPKIQK)，同源度和进化分析发现两种泥鳅HSP70序列具有高度保守性。重组蛋白诱导表达后，SDS-PAGE电泳结果显示，泥鳅的两种重组蛋白分子量分别为78.9kD和88.3kD（含部分载体蛋白），经过温度梯度和IPTG浓度梯度优化，37℃、IPTG浓度为1mmoL、诱导表达6h为它们的最优表达条件。相对荧光Real-timePCR结果表明HSP60和HSP70参与了鱼鳍再生过程，再生过程中的作用可能与断面表皮细胞的形成以及芽基的形成相关，还可能与损伤蛋白的折叠、修复以及抗凋亡相关。

目录

摘要

1 前言

1．1 热激蛋白(HSPs)研究概况

1．1．1 热激蛋白的发现

1．1．2 热激蛋白的分类与分布

1．1．3 热激蛋白的特性

1．1．4 热激蛋白基因的表达调控

1．1．5 HSP60和HSP70的结构

1．2 鱼鳍再生的研究进展

1．2．1 鱼鳍再生的基本过程及组成

1．2．2 鱼鳍再生过程中相关基因

1．2．3 药物对鱼鳍再生的影响

1．2．4 鱼鳍再生的其他研究成果

1．3 研究热激蛋白与鱼鳍再生的目的及意义

1．3．1 研究目的

1．3．2 研究意义

2 材料与方法

2．1 材料

2．1．1 实验动物

2．1．2 载体和宿主菌

2．1．3 引物

2．1．4 常用设备和仪器

2．1．5 主要试剂

2．1．6 本研究常用溶液配方

2．2 方法

2．2．1 组织总RNA的提取

2．2．2 反转录cDNA

2．2．3 两种泥鳅HSP60和HSP70基因cDNA序列的克隆

2．2．4 两种泥鳅HSP60和HSP70基因cDNA序列的测序与分析

2．2．5 两种泥鳅尾鳍剪后再生过程中HSP60和HSP70表达谱分析

2．2．6 两种泥鳅HSP60和HSP70基因ORF的原核表达

3 结果与分析

3．1 两种泥鳅HSP60和HSP70基因cDNA序列的克隆

3．1．1 总RNA的提取

3．1．2 两种泥鳅HSP60和HSP70基因保守区域的克隆

3．1．3 RACE扩增两种泥鳅HSP60和HSP70基因3'端序列结果

3．1．4 RACE法扩增两种泥鳅HSP60和HSP70基因5'端序列结果

3．2 两种泥鳅中HSP60和HSP70基因的序列分析

3．2．1 两种泥鳅中HSP60基因序列分析

3．2．2 两种泥鳅中HSP70基因序列分析

3．3 两种泥鳅HSP60和HSP70基因与其他物种的同源性和系统进化分析

3．3．1 两种泥鳅HSP60同源性和系统进化分析

3．3．2 两种泥鳅中HSP70基因序列同源性和系统进化分析

3．4 两种泥鳅尾鳍再生过程中HSP60和HSP70基因的表达模式

3．4．1 两种泥鳅尾鳍再生过程中HSP60基因的表达分析

3．4．2 两种泥鳅尾鳍再生过程中HSP70基因的表达分析

3．5 泥鳅HSP60基因原核表达结果与分析

3．5．1 泥鳅HSP60重组质粒的构建

3．5．2 泥鳅HSP60重组菌体的诱导表达与优化分析

3．6 泥鳅HSP70基因原核表达结果分析

3．6．1 泥鳅HSP70重组质粒的构建

3．6．2 泥鳅HSP70重组菌体的诱导表达与优化分析

4 讨论

4．1 两种泥鳅HSP60和HSP70基因的克隆及其序列分析

4．2 两种泥鳅尾鳍再生过程中HSP60和HSP70基因的表达分析

4．3 大鳞副泥鳅HSP60和HSP70基因的原核表达结果分析

参考文献

致谢

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