重组人白细胞介素1β(rhIL-1β)在毕赤酵母中的表达、纯化及生物学作用研究

摘要

白细胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）是一个重要的促炎性细胞因子，参与多种疾病的生理病理反应，具有潜在的应用价值。目前关于人IL-1β表达的研究主要是采用原核表达系统，由于大肠杆菌表达重组蛋白表达量低、存在内毒素、分离纯化复杂、蛋白回收率低等缺点，因此，本文选用真核表达系统即巴斯德毕赤酵母表达系统表达人IL-1β蛋白，达到提高蛋白产量和回收率的目的。本文首先根据编码人IL-1β的mRNA序列，利用在线优化工具对其基因序列进行优化，然后分别导入毕赤酵母表达载体pPIC9、pPIC9K和pPICZαA，成功构建人IL-1β重组载体，并将其转染至毕赤酵母菌GS115、SMD1168和X-33，从重组毕赤酵母菌中筛选得到正确且高效表达的工程菌株，然后进一步探讨其3L规模的发酵条件、产物纯化工艺及鉴定其生物学作用。
　　本文首先对重组表达载体pPIC9-hIL-1β、pPIC9K-hIL-1β和pPICZαA-hIL-1β进行鉴定，并将其电转化整合到毕赤酵母受体菌GS115、SMD1168和X-33的基因组中，涂布在MD和YPD+Z平板，待长出单克隆后，用基因组PCR鉴定来筛选阳性克隆，然后通过BMGY培养基诱导培养5天，进行SDS-PAGE和Western Blot蛋白鉴定，最终筛选出可正确高效表达的重组菌株X-33-pPICZαA-hIL-1β。
　　本文在3L发酵罐规模下，通过研究诱导阶段中不同的起始诱导菌体密度(OD)、温度、pH、溶解氧体积分数(DO)和甲醇浓度及诱导时间五个因素对毕赤酵母生长和目的蛋白表达影响，从而确定出最佳诱导条件。实验结果表明，X-33-pPICZαA-hIL-1β工程菌株在3L发酵规模下，最佳诱导条件为起始诱导菌体密度(OD600)为600，温度26℃，pH为5.0，溶氧体积分数20％，甲醇浓度0.25％，诱导3天，rhIL-1β的表达量最高，可达280mg/L。
　　本文对rhIL-1β分离纯化方法进行了初步研究，研究结果显示，首先采用低温离心法去除大部分菌体，然后用磷酸氢二钾/无水乙醇双水相体系对收集的发酵液上清进行抽提，收集上相溶液，经10kD超滤、浓缩，最后经DEAE弱阴离子交换层析分离纯化方法，可以得到纯度在95％左右，收率75％的rhIL-1β。
　　本文分别采用MTT法和Hoechst33258染色法对获得的重组蛋白进行初步的生物学活性检测，MTT法实验数据显示，rhIL-1β对人肝癌细胞株HepG2和小鼠黑素瘤细胞株B16具有增殖抑制作用，通过显微镜观察rhIL-1β处理过的HepG2和B16细胞发现，rhIL-1β可促进上述两种癌细胞的凋亡。
　　综上所述，本文为rhIL-1β的工业化生产及研究其生物学作用奠定基础，也为研发抗肿瘤新药提供实验依据。

目录

摘要

缩略语表

第一章 文献综述

1．1 白细胞介素-1的概述

1．1．1 IL-1的结构与受体

1．1．2 IL-1的生物学作用

1．1．3 IL-1与疾病的关系

1．1．4 IL-1的研究现状

1．2 毕赤酵母表达系统

1．2．1 毕赤酵母表达系统的优点

1．2．2 影响外源蛋白在毕赤酵母中的表达因素

1．2．3 毕赤酵母表达系统的应用前景

1．3 蛋白的分离纯化

1．3．1 分离纯化方法

1．3．2 分离纯化的过程

1．3．3 毕赤酵母表达外源蛋白质的纯化方法

1．3．4 蛋白分离纯化方法的应用与展望

第二章 rhIL-1β的工程菌构建、筛选和鉴定

2．1 材料与方法

2．1．1 实验材料

2．1．2 实验仪器

2．1．3 实验试剂

2．1．4 主要试剂及培养基的配制

2．1．5 实验方法

2．2 结果

2．2．1 rhIL-1β表达质粒的鉴定

2．2．2 rhIL-1β转化子验证及重组蛋白表达

2．3 讨论

第三章 rhIL-1β的3L规模发酵条件优化及分离纯化

3．1 材料与方法

3．1．1 实验材料

3．1．2 实验设备

3．1．3 实验试剂

3．1．4 主要试剂及培养基的配制

3．1．5 实验方法

3．2 实验结果

3．2．1 rhIL-1β工程菌的3L规模发酵工艺的优化

3．2．2 rhIL-1β的分离纯化

3．3 讨论

第四章 rhIL-1β的生物学活性检测

4．1 材料与方法

4．1．1 实验材料

4．1．2 实验仪器

4．1．3 实验试剂

4．1．4 溶液配制

4．1．5 实验方法

4．2 实验结果

4．2．1 MTT检测

4．2．2 Hoechst33258染色

4．3 讨论

结论

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间参加的科研项目及已发表的论文

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