重组人白细胞介素-1α(rhIL-1α)的毕赤酵母表达及生物学作用研究

摘要

人白细胞介素-1α(hIL-1α)在抗肿瘤等方面具有潜在的应用价值。目前，重组hIL-1α(rhIL-1α)表达主要是通过大肠杆菌表达系统，但大肠杆菌表达系统存在蛋白分离纯化工艺复杂等缺点。
　　酵母表达系统具有蛋白表达后修饰及分离纯化工艺简单等优点，本文构建了rhIL-1α毕赤酵母工程菌，挑选表达量高的菌株，在1L摇瓶和3L发酵罐规模下进行了表达条件的优化，在10L和50 L发酵罐规模进行了样品的获取、产物纯化工艺以及初步的活性研究。为rhIL-1α的产业化研究奠定了基础。主要研究包括:
　　1、本研究对hIL-1α的cDNA序列进行设计和优化，采用pPICZαA作为目的基因的表达载体，通过电转化法将重组质粒转化至X-33毕赤酵母。通过基因组PCR鉴定，MM和MD平板筛选，SDS-PAGE鉴定等方法筛选得到高表达且遗传稳定的rhIL-1α工程菌。
　　2、在1L摇瓶规模下对rhIL-1α工程菌的发酵条件进行优化。结果表明，在pH5.5、26℃、甲醇浓度0.25％条件下，rhIL-1α的表达量最高(19 mg/L)。
　　3、在3L发酵罐规模下对rhIL-1α工程菌的发酵条件进行优化。结果表明，在pH5.5、26℃、甲醇浓度0.25％条件下，rhIL-1α的表达量最高(180 mg/L)。
　　4、扩大发酵规模获取样品。在pH5.5、26℃、甲醇浓度0.25％条件下，10L和50L发酵罐中的表达量分为251 mg/L和307 mg/L。
　　5、对rhIL-1α的分离纯化条件进行摸索。通过高速低温离心、双水相、超滤以及DEAE阴离子交换层析处理后，获得了纯度高于90％，收率大于50％的目的蛋白。
　　6、采用MTT法检测rhIL-1α对人肝癌细胞BEL-7402的作用并证明rhIL-1α能够抑制人肝癌细胞7402的增殖。为进一步研究rhIL-1α对肿瘤的临床治疗奠定了理论基础。

目录

摘要

缩略语表

1 前言

1．1 白细胞介素1α(IL-1α)的性质与作用

1．1．1 IL-1α的分子结构

1．1．2 IL-1α的性质

1．1．3 IL-1α与疾病

1．2 重组蛋白的表达系统

1．2．1 原核表达系统

1．2．2 酵母表达系统

1．2．3 动物细胞表达系统

1．2．4 植物细胞表达系统

1．3 重组人白细胞介素1α(rhIL-1α)在毕赤酵母中的表达

1．3．1 毕赤酵母表达系统的优势

1．3．2 毕赤酵母表达菌株

1．3．3 毕赤酵母表达载体

1．3．4 毕赤酵母的转化

1．3．5 毕赤酵母工程菌株的筛选及鉴定

1．3．6 毕赤酵母工程菌的发酵

1．3．7 毕赤酵母工程菌的分离纯化

1．4 研究目的与意义

2 材料和方法

2．1 材料

2．1．1 实验材料

2．1．2 主要试剂

2．1．3 储存液

2．1．4 培养基

2．1．5 主要实验仪器

2．2 实验方法

2．2．1 rhIL-1α基因序列合成

2．2．2 重组表达质粒pPIC9K-rhIL-1α的构建

2．2．3 毕赤酵母感受态的制备

2．2．4 表达质粒的线性化

2．2．5 转化

2．2．6 筛选阳性克隆

2．2．7 rhIL-1α工程菌的表达

2．2．8 SDS-PAGE检测

2．2．9 rhIL-1α免疫印迹鉴定

2．2．10 rhIL-1α工程菌摇瓶条件下最佳表达条件的探究

2．2．11 rhIL-1α工程菌3L发酵罐中的最佳表达条件摸索

2．2．12 rhIL-1α工程菌10L条件下发酵罐的样品获取

2．2．13 rhIL-1α工程菌50L发酵罐中的样品获取

2．2．14 蛋白浓度测定

2．2．15 rhIL-1α分离纯化

2．2．16 MTT检测

3 实验结果

3．1 工程菌的构建

3．1．1 质粒的鉴定

3．1．2 阳性克隆的筛选

3．1．3 PCR鉴定

3．2 含rhIL-1α基因工程菌的诱导筛选

3．3 rhIL-1α工程菌的摇瓶发酵

3．3．1 最佳温度优化结果

3．3．2 最佳pH优化结果

3．3．3 最佳装液量优化结果

3．3．4 最佳甲醇浓度优化结果

3．3．5 温度、pH双因素优化结果

3．4 rhIL-1α工程菌3 L发酵罐的表达

3．4．1 最佳温度优化结果

3．4．2 最佳pH优化结果

3．4．3 最佳甲醇浓度优化结果

3．4．4 温度、pH双因素条件优化

3．5 rhIL-1α工程菌10L发酵罐的表达

3．6 rhIL-1α工程菌50L发酵罐的表达

3．7 分离纯化

3．7．1 双水相萃取条件的优化

3．7．2 超滤

3．7．3 DEAE离子交换层析

3．8 rhIL-1α对BEL-7402细胞的生物学作用

4 讨论

结论

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间参加的科研项目及已发表的论文

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