高产纤维素酶菌株的筛选、鉴定及内切葡聚糖酶高表达基因工程菌的构建

摘要

纤维素在地球上分布广泛，随处可见，我国地大物博，资源丰富，纤维素资源也是极其丰富，但是，由于其结构稳定、不易水解等特点，大大限制了其利用范围。如果可以利用大量微生物，让它们产生降解纤维素的酶，通过酶将纤维素分解转化，不仅可以解决环境污染的问题，而且可以合理利用纤维素资源。此外，纤维素资源的合理利用，对开发饲料资源，生产农业能源，发展畜牧业资源，减轻人类对环境的污染都具有重大的意义。
　　虽然人们在纤维素酶的筛选方面，做了大量研究工作，并且也获得了一定的成果，但是截止到现在，产酶能力高的菌株由于其自身的诸多局限，没有被很好的利用。随着生物技术的发展，有关β-内切葡聚糖酶基因的克隆和表达的研究越来越深入，但是，由于各种条件如耐热性差，稳定性差等的限制，真正转化为生产实践的基因工程菌少之又少。因此，利用合理的方法构建高表达β-内切葡聚糖酶基因工程菌并应用于生产实践，将大大加快纤维质原料在工农业生产的利用步伐。
　　1.本实验采用刚果红染色法(Congo red staining)，选择灌木丛、腐木、稻杆堆积等纤维素含量丰富的土壤中取样，通过羧甲基纤维素钠固体培养基富集后分离单菌落，以刚果红染色法(Congo red staining)进行复筛，筛出6株水解圈大，CMC酶活力高的菌株，编号后，对它们进行16S rDNA及生理生化的鉴定，结果发现，2号为蜡状芽孢杆菌（Waxy bacillus），5号为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)，9号为巨大芽孢杆菌(Huge bacillus)，10号为地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)，11号为微小杆菌（Tiny bacteria），12号为绿色木霉（Greentrichoderma viride）。利用候选菌株对两种不同的纤维质材料麸皮和米糠进行固态发酵，DNS法测量了OD值，计算出发酵后的酶活力，结果显示，地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)发酵后的酶活力最强，麸皮和米糠作为底物发酵后酶活值分别达到3437U/ml和8541U/ml，为工农业生产及畜牧业带来了巨大的的应用前景和经济效益。
　　2.在上述候选菌株中，本研究选择酶活力最大的10号菌株地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)作为研究对象，对其生长条件包括发酵温度、时间及含水量进行优化，结果发现:当培养温度为30℃，培养时间达到60 h，初始水分含量为40％时，其产酶能力达到最大。为进一步利用此菌株进行工业化生产和饲料研究奠定了理论基础，也为以后的应用指明了方向。
　　3.依据已公布的纤维素内切葡聚糖酶基因(www.ncbi.nlm.nih.gov)，设计特异性引物，进行PCR扩增获得一长度为732bp的特异产物，测序后发现该基因序列与公布的纤维素酶基因片段同源性达99％，表明成功克隆到该基因。
　　4.在上述获得的纤维素酶基因两端引入ECOR1和HandⅢ酶切位点，重新设计引物获得PCR产物后，将该纤维素酶基因连接到PET-28a载体上，并转化到大肠杆菌，获得基因工程菌。酶切后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，成功获得大小为27.1KD的表达产物。从而证明，该基因工程菌成功构建并表达出预期产物。通过与10菌株酶活力的进行比较后发现，该重组菌的酶活力有明显的提高。

目录

摘要

1 前言

1．1 纤维素

1．2 纤维素酶的组成

1．3 纤维素酶的来源

1．4 纤维素酶的作用机理

1．5 纤维素酶的应用

1．6．纤维素酶活力的测定

1．7 课题研究背景及国外研究现状的分析

1．8 纤维素酶基因的克隆与表达

1．9 本研究的目的和意义

2 高产纤维素酶菌菌株的筛选及鉴定

2．1 材料和方法

2．1．1 样品的采集

2．1．2 试剂

2．1．3 仪器设备

2．2 实验方法

2．2．1 培养基的制备

2．2．2．酶活力的测定

2．2．3 产纤维素酶菌的筛选

2．2．4 利用刚果红CMC固体培养基测量水解圈直径

2．2．5 菌种的分类及鉴定

2．3 结果分析和讨论

2．3．1 菌株的筛选

2．3．2 菌株形态学鉴定结果

2．3．3 指纹代谢分析

2．3．4 菌株种属鉴定

2．4 讨论

2．5 结论

3 发酵条件的探索及目的菌株产酶能力的研究

3．1 材料和方法

3．1．1 主要试剂

3．1．2 仪器设备

3．1．3 溶液的配制

3．2 纤维素酶活力的测定

3．3 结果分析和讨论

3．3．1 发酵时间对酶活力的影响

3．3．2 发酵温度对酶活力的影响

3．3．3 含水量对生长及产酶的影响

3．4 讨论

4 地衣芽孢杆菌内切葡聚糖酶基因的克隆及表达

4．1 材料与方法

4．1．1 菌株

4．1．2 药品与酶

4．1．3 引物的设计

4．1．4 培养基和主要试剂的配制方法

4．2 实验方法

4．2．1 地衣芽孢杆菌总RNA的提取，cDNA反转录

4．2．2 内切葡聚糖酶基因的克隆

4．2．3 琼脂糖核酸电泳

4．2．4 目的片段的回收

4．2．5 连接

4．2．6 重组质粒转化大肠杆菌

4．2．7 质粒的提取方法

4．2．8 内切葡聚糖酶基因的PCR

4．2．9 琼脂糖凝胶核酸电泳

4．2．10 双酶切反应

4．2．11 重组表达载体的构建

4．2．12 表达质粒构建

4．2．13 把目的基因转化到大肠杆菌

4．2．14 挑单克隆

4．2．15 蛋白质的诱导表达

4．2．16 SDS-PAGE电泳

4．2．17．地衣芽孢杆菌和工程菌的酶活力的比较

4．3 结果分析与讨论

4．3．1 酶基因PCR扩增

4．3．2 酶切鉴定

4．3．3 表达产物的SDS-PAGE凝胶电泳

4．3．4 酶学性质的探究

4．4 讨论

4．5 结语和展望

参考文献

致谢

攻读学位期间发表的学术论文目录

声明