鲤嗜水气单胞菌弱毒株筛选及免疫原性评价

摘要

嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)是一种革兰氏阴性细菌，可以引起鲤（Cyprinuscarpio）、鲫（Carassius aumtus）等多种淡水养殖鱼类细菌性败血症的爆发，对渔业生产造成严重的经济损失。目前，我国主要使用化学药物对鱼病进行防控，大量化学药物的使用会导致药物残留，破坏生态环境，并且为超级细菌的产生创造条件，所以使用疫苗对鱼病进行免疫防控是未来的发展趋势。然而我国尚未普及以疫苗为主的鱼病防控方法。原因主要有两方面:首先由于现阶段研制的鱼用疫苗免疫效果不稳定;另一方面疫苗导入方法不够高效，难以满足生产需求。所以，研发高效稳定，操作简便的鱼用疫苗是现阶段鱼类疾病防控研究的重点。本论文针对由嗜水气单胞菌引起的传染性疾病，开展了鲤嗜水气单胞菌弱毒疫苗的研制及不同导入途径的疫苗免疫效果评价。旨在找到一种可广泛应用于水产养殖业，高效稳定、操作简便的嗜水气单胞菌弱毒疫苗，预防由嗜水气单胞菌引起的细菌性败血症，并为鱼用疫苗免疫效果评价标准的建立提供参考。本论文主要内容如下:
　　1.利福平筛选嗜水气单胞菌弱毒菌株
　　以采自新乡本地的高致病性鲤嗜水气单胞菌菌株XX1为研究对象，通过利福平梯度浓度筛选，获得一株毒性明显降低，以正常攻毒剂量未导致鲤发病的弱毒菌株，命名为XX1LA菌株。经测定，XX1LA的半数致死量(LD50)为4.5×109 CFU/ml是XX1半数致死量的200倍。用100μl浓度为106 CFU/ml的XX1LA进行攻毒实验，鲤并未出现嗜水气单胞菌感染症状及死亡现象，体外连续培养及体内多次攻毒和回收实验过程中，XX1LA毒性无复壮现象，表现出良好的稳定性。实验结果表明，经利福平筛选获得的嗜水气单胞菌弱毒菌株XX1LA具有毒性大幅减弱、无致病性及稳定性高等特点，可以作为制备嗜水气单胞菌弱毒疫苗的候选菌株。
　　2.嗜水气单胞菌弱毒疫苗XX1LA免疫效果评价
　　本论文采用相对免疫保护率(RPS)、血清特异性抗体效价、血清溶菌酶活性和免疫相关基因表达水平等指标，对XX1LA的免疫效果进行评价，并与传统的福尔马林灭活嗜水气单胞菌疫苗的免疫效果进行比较，结果显示:免疫14d后XX1LA组的相对免疫保护率(83.7％)显著高于灭活疫苗组(37.2％)(P＜0.05);XX1LA和灭活疫苗组血清特异性抗体效价在免疫28 d内逐渐升高，并在免疫14d后显著高于对照组，XX1LA组在免疫28 d后，血清特异性抗体效价与灭活疫苗组和对照组间均存在显著性差异（P＜0.05）;;免疫相关基因IL-1β、IL-10和IgM在肝脏和脾脏中的表达量在免疫后均有上调;但是，对于血清中溶菌酶活性而言，实验组与对照组之间无显著性差异。研究结果表明，XX1LA对鲤呈现出较好的免疫保护效果。
　　3.不同方法导入弱毒疫苗XX1LA的免疫效果比较
　　本论文采用浸泡和腹腔注射两种方法，导入嗜水气单胞菌弱毒疫苗XX1LA。分别从血清溶菌酶活性，血清特异性抗体凝集效价和相对免疫保护率三个方面评价两种导入方法的免疫效果。实验结果表明，血清溶菌酶活性在疫苗导入后7d和14d时，浸泡组和注射组显著高于对照组（P＜0.05）;血清特异性抗体凝集效价在免疫后14-28 d，浸泡组和注射组均显著高于对照组(P＜0.05)，浸泡组与注射组之间无显著性差异;注射组和浸泡组的相对免疫保护率分别达到78.85％和80.77％，两种疫苗导入方法均呈现出良好的免疫保护效果。实验结果表明，弱毒疫苗XX1LA采用浸泡法导入鲤鱼种后，可以刺激机体产生非特异性和特异性免疫应答，能够有效防控由嗜水气单胞菌引发的细菌性败血症，免疫保护效果与注射法基本一致，为简化实际生产中疫苗导入方法提供了理论依据。

目录

摘要

第一章 文献综述

1．1 嗜水气单胞菌疫苗的研究现状

1．1．1 新型疫苗

1．1．2 灭活疫苗

1．1．3 弱毒疫苗

1．2 疫苗导入方法的研究进展

1．2．1 注射免疫

1．2．2 浸泡免疫

1．2．3 口服免疫

1．3 疫苗免疫效果评价的研究进展

1．3．1 非特异性免疫评价指标

1．3．2 特异性免疫评价指标

1．3．3 相对免疫保护率(RPS)

1．4 本论文研究目的与意义及技术路线

第二章 采用利福平筛选鲤嗜水气单胞菌弱毒株

2．1 材料与方法

2．1．1 实验材料

2．1．2 实验方法

2．2 实验结果

2．2．1 菌液浓度与吸光度值的标准方程

2．2．2 菌株XXlLA的鉴定和菌落形态

2．2．3 弱毒菌株XXlLA的毒力和稳定性

2．3 讨论

第三章 嗜水气单胞菌弱毒疫苗XXlLA免疫效果评价

3．1 材料与方法

3．1．1 实验材料

3．1．2 实验方法

3．2 实验结果

3．2．1 灭活疫苗和XXlLA对鲤鱼种的相对免疫保护率

3．2．2 疫苗免疫后对血清溶菌酶活性的影响

3．2．3 疫苗免疫后血清中特异性抗体效价的变化

3．2．4 疫苗免疫后鲤免疫相关基因表达量的变化

3．3 讨论

第四章 不同导入方式对嗜水气单胞菌弱毒疫苗XXlLA免疫效果的影响

4．1 材料与方法

4．1．1 实验用鲤鱼种

4．1．2 实验鱼的饲养管理

4．1．3 菌株及培养条件

4．1．4 主要实验仪器和设备

4．1．5 鱼种的免疫与攻毒实验

4．1．6 相对免疫保护率测定

4．1．7 血清特异性抗体凝集效价测定(微量凝集反应)

4．1．8 血清溶菌酶活性的测定

4．1．9 统计分析

4．2 结果

4．2．1 血清溶菌酶活性

4．2．2 免疫后不同时间血清抗体凝集效价

4．2．3 攻毒后鲤鱼种相对免疫保护率

4．3 讨论

4．3．1 疫苗不同导入方法对血清溶菌酶活性的影响

4．3．2 疫苗不同导入方法对血清抗体凝集效价和免疫保护率的影响

第五章 研究成果与展望

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间发表论文

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