adh2缺失型纤维乙醇工程菌菌株构建研究

摘要

本文从嗜鞣管囊酵母P-01(Pachysolen tannophilus)出发，利用wood氏法测定了在发酵过程中乙醇脱氢酶(ADH Ⅱ)Ⅱ酶活，结果表明：发酵过程中P-01的ADH Ⅱ酶活性明显高于对照菌株南阳酒精酵母1308(Saccharomyces cerevisiae)。 通过对NCBI中存在的Saccharomyceskluyveri、Pichiasnpitisalcohol、CandidaalbicansSC5314、Saccharomyces cerevisiae四个菌株所具有的乙醇脱氢酶Ⅱ基因(adh2)进行同源性分析比对，设计同源性引物，克隆嗜鞣管囊酵母P-01的adh2。通过聚合酶链式反应(PCR)克隆得到了一段长为340bp的片段，同源性分析表明：其为嗜鞣管囊酵母P-01的adh2部分片段。利用RACE法克隆得到了嗜鞣管囊酵母P-01的adh2。并向NCBI注册了序列，序列号分别为EU570211，EU590042。 采用基因敲除技术定向敲除嗜鞣管囊酵母P-01的adh2，重组子通过PCR、全糖发酵等试验进行筛选，最后得到两株能够同时发酵木糖和葡萄糖、比较优良、adh2缺失的菌株MC和ND。发酵结束时乙醇度分别达到2.0％(v/v)、2.4％(v/v)，原菌P-011.85％(v/v)，ND、MC发酵产乙醇性能比P.0提高了5.2％和19.4％，乙醇产率达到理论值的74.5％和85.1％。 最后对重组子ND、MC在玉米秸秆水解液中的发酵性能进行了研究。ND、MC发酵玉米秸秆水解液乙醇浓度达到1.25％(v/v)、1.15％(v/v)，高于亲株P-01 0.95％(v/v)，P-01、ND、MC乙醇产率为43.9％、57.8％、53.2％，MC、ND发酵产乙醇性能比P-01提高了9.3％和13.9％。

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摘要

第一章文献综述

1能源状况

2纤维燃料乙醇

3基因敲除技术概述

3.1基因敲除技术的概念

3.2基因敲除的原理和方法

3.3基因敲除技术的应用及前景

3.4基因敲除技术的缺陷

4嗜鞣管囊酵母P-01的性能

5本课题的目的意义

6本课题研究的内容及技术路线

第二章嗜鞣管囊酵母P-01乙醇脱氢酶Ⅱ活性测定及其对乙醇发酵的影响

1材料与方法

1.1材料

1.2方法

2结果与分析

2.1酶活分析

2.2酸度与pH值分析

3本章小结

第三章嗜鞣管囊酵母P-01乙醇脱氢酶Ⅱ基因克隆

1材料与方法

1.1材料

1.2方法

2结果与分析

2.1嗜鞣管囊酵母P01，南阳酒精酵母1308基因组DNA

2.2嗜鞣管囊酵母P01RNA

2.3乙醇脱氢酶Ⅱ基因克隆

2.4乙醇脱氢酶Ⅱ基因克隆测序结果分析

2.5 3'Race结果

2.6 5'RACE结果

2.7全长基因的克隆

2.7同源性分析

3本章小结

第四章嗜鞣管囊酵母P-01乙醇脱氢酶Ⅱ基因的敲除

1材料与方法

1.1材料

1.2方法

2结果与分析

2.1嗜鞣管囊酵母P-01生长曲线

2.2嗜鞣管囊酵母P-01对G418的最低耐受性

2.3重组子的验证实验

2.4重组子ND、MC的验证实验

3本章小结

第五章结论与讨论

1结论

2讨论

2.1DNA提取方法

2.2基因敲除的完整性

2.3重组子酒精产率提高的进一步验证

2.4全糖发酵重组子的基础性研究

2.5MC、ND的进一步改造建议

2.6adh2的后续研究

参考文献