猪繁殖与呼吸综合征病毒的分离、鉴定及ORF5基因的克隆及变异分析

摘要

猪繁殖与呼吸综合征（porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒引起的一种新的、高度传染性疾病，临床上以母猪发热、厌食、早产、流产、木乃伊胎、死胎、弱仔等繁殖障碍及各种年龄猪的呼吸症状和仔猪的高死亡率为特征。该病最早于1987年报道于美国南部，现已遍及世界各地，给全球养猪业造成巨大的经济损失。近年来，全国各地很多猪场都出现了以母猪繁殖障碍、仔猪呼吸困难为特征的传染病。为了弄清病因，解决生产实际，特此开展了猪繁殖与呼吸综合征病毒的分离和鉴定工作。 利用MARC-145细胞，从河南原阳地区发病猪的肺脏中分离到疑似PRRSV毒株，并对其中一株病毒进行了全面的鉴定。该病毒在MARC-145细胞上增殖滴度为10-4．39/0．1ml。能被美洲型PRRSV阳性血清所中和，而不能被抗猪瘟病毒、猪伪狂犬病病毒、猪细小病毒的阳性血清中和。为了进一步从分子生物学进行鉴定，设计了特异性引物对病毒的囊膜蛋白基因（ORF6）进行了RT-PCR扩增，扩增到大小约为500bp的片段，与预期大小相当，而阴性对照则不能扩增出相应大小的片段。根据以上结果，证实所分离的病毒为猪繁殖与呼吸综合征病毒，并且属于美洲型，命名为PRRSV HN-Y株。 采用RT-PCR扩增了PRRSV HN-Y株ORF5基因完整cDNA，并进行了克隆与序列测定，结果发现PRRSV HN-Y株ORF5可编码200个氨基酸残基，与PRRSV欧洲型代表株（LV株）、美洲型代表株（VR-2332株）以及国内首株分离株CH-1a的ORF5氨基酸同源性分别为58％、90％和95％，进化系统树分析也表明PRRSV HN-Y株与美洲型毒株具有更强的亲源关系，据此推测PRRSV HN-Y株属于北美洲亚群。但PRRSV HN-Y株ORF5在预测的N-糖基化位点与抗原位点方面与其它美洲型代表株存在差异。

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致谢

1.文献综述

1.1 猪繁殖与呼吸综合征病毒的特性

1.1.1 病毒的分类及理化性质

1.1.2 抗原性

1.1.3 PRRSV的体外生长特性

1.1.4 致病机制

1.1.5 流行病学

1.2 PRRSV分子生物学研究进展

1.2.1 基因组结构与功能

1.2.2 蛋白质

1.2.3 PRRSV基因组的变异

1.2.4 生物学和抗原性变异

1.3 PRRS诊断方法研究进展

1.3.1 病原学诊断

1.3.2 血清学诊断

2.引言

3 实验材料与方法

3.1 实验材料

3.1.1 细胞

3.1.2 血清

3.1.3 菌种与质粒

3.1.4 主要药品与试剂

3.1.5 主要培养基

3.1.6 细胞消化液

3.1.7 实验中所使的引物

3.1.8 实验所用缓冲液

3.2 实验方法

3.2.1 病料采集与处理

3.2.2 细胞的培养

3.2.3 病毒的分离

3.2.4 TCID50 的测定

3.2.5 中和试验

3.2.6 PRRSY基因组RNA的提取

3.2.7 RT—PCR扩增与检测

3.2.8 RT—PCR产物的回收与纯化

3.2.9 大肠杆菌感受态细胞的制备

3.2.10 回收产物的连接

3.2.11 连接产物的转化

3.2.12 质粒的制备

3.2.13 阳性克隆质粒的鉴定及其序列的测定与分析

4.结果与分析

4.1 病料接种细胞后的细胞病变

4.3 中和试验的结果

4.4 PCR鉴定结果

4.5 PRRSV HN-Y株ORF5 基因cDNA的扩增与克隆

4.6 ORF5 基因核苷酸序列测定

4.7 序列比较

4.8 系统发育树分析

4.9 疏水性、糖基化位点和抗原性分析

5.结论与讨论

5.1 PRRSV ORF5 基因的遗传变异

5.2 GP5 信号肽的预测

5.3 GP5 的抗原漂移

参考文献