三种甘薯病毒多重RT-PCR检测方法的建立及甘薯脉花叶病毒(SPVMV)的分子鉴定

摘要

甘薯病毒病害造成甘薯产量降低，品质变劣和种性退化，对甘薯生产造成严重危害。种植脱毒甘薯是防治病毒病、提高甘薯产量最有效的方法之一。明确侵染甘薯的主要病毒种类，建立高效快速的病毒检测技术是培育脱毒甘薯的关键。甘薯羽状斑驳病毒（Sweet potato feathery mottle virus，SPFMV）、甘薯潜隐病毒（Sweet potato latent virus，SPLV）、甘薯G病毒（Sweet potato virus G，SPVG）和甘薯脉花叶病毒（Sweet potato vein mossaic virus，SPVMV）是侵染甘薯的主要马铃薯Y属（potvirus）病毒，几种病毒常常混合侵染。目前用于甘薯病毒检测的常用方法是酶联免疫吸附（ELISA）技术，由于ELISA技术的灵敏度较低，而且几种病毒的抗体之间常常有交互反应，不能进行特异性检测。本文拟探索建立同时检测3种甘薯病毒的多重RT-PCR技术，并通过克隆SPVMV基因组3'端部分序列，明确其分子特征，为进一步的研究奠定基础。 依据SPFMV、SPLV和SPVG CP基因保守区的核苷酸序列设计了3对特异性引物用于建立3种甘薯病毒的多重RT-PCR检测方法。3种病毒预期扩增的目的片段大小分别为300bp，420 bp和600 bp，以单一 PCR反应体系为基础，分别对混合引物浓度、Taq DNA聚合酶浓度、MgCl2浓度和退火温度等反应条件进行优化，建立了同时检测3种甘薯病毒的多重RT-PCR方法。 根据已报道的SPVMV基因组3'端的核苷酸序列设计引物，以感病的巴西牵牛（Ipomoease tosa）叶片总RNA为模板，利用RT-PCR扩增获得了SPVMV河南分离物（SPVMV-HN）基因组3'端约1．86kb的目的片段，此片段包括部分NIb基因序列和完整的CP基因及3'端非编码区（3'UTR）序列。SPVMV-HN CP基因由996个核苷酸组成（GenBank登录号为FJ687211），共编码332个氨基酸残基。SPVMV-HN CP基因与已发表的其它分离物CP基因的核苷酸序列一致性在89．3％-99．3％之间，推导的氨基酸序列一致性在95．2％-98．5％之间；与广东分离物（AY459611）和葡萄牙分离物（AY459604）的核苷酸序列一致性分别为98．9％和99．3％，与南非分离物（AY459608）的核苷酸序列一致性为89．3％；利用基因工程方法，将SPVMV-HN CP基因克隆到原核表达载体pET-28a（+）上，成功构建了原核表达载体pETVMVCP。SDS-PAGE分析表明，经IPTG诱导，CP基因在大肠杆菌BL21（DE3）pLysS中得到了高效表达。

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致谢

1 文献综述

1.1 甘薯

1.1.1 甘薯的生产现状

1.1.2 甘薯的用途

1.2 甘薯病毒病发生情况

1.3 甘薯脉花叶病毒研究进展

1.4 甘薯病毒病检测技术研究进展

1.4.1 症状诊断法

1.4.2 生物学鉴定方法

1.4.3 病毒形态鉴定法

1.4.4 血清学方法

1.4.5 分子生物学方法

2 引言

3 材料和方法

3.1 材料

3.1.1 供试毒源

3.1.2 寡核营酸引物

3.1.3 菌株和质粒

3.1.4 酶和试剂(盒)

3.2 方法

3.2.1 基本的分子生物学方法

3.2.2 三种甘薯病毒多重RT-PCR检测方法的建立

3.2.3 SPVMV基因组3’端序列的克隆和序列测定

3.2.4 SPVMV CP基因原核表达载体的构建

3.2.5 外源基因的诱导表达

4 结果与分析

4.1 三种甘薯病毒多重RT-PCR检测方法的建立

4.1.1 多重PCR反应条件的初步筛选

4.1.2 多重PCR和单一PCR扩增效果的比较

4.1.3 多重PCR产物的序列测定

4.2 SPVMV基因组3’端序列的克隆和序列测定

4.3 SPVMV基因组3’端序列的比较与分析

4.4 SPVMV CP基因在大肠杆菌中的表达

4.4.1 SPVMV CP基因原核表达载体的构建

4.4.2 表达产物的SDS-PAGE分析

5 结论与讨论

5.1 结论

5.2 讨论

参考文献