打顶前后烟草miRNA表达谱的生物信息学分析及靶基因的电子克隆

摘要

microRNAs(miRNAs)是调控基因表达的重要因子。参与植物整个生长发育进程的调控。大多数miRNAs的靶基因是编码调控蛋白的基因，说明miRNAs是植物中主要的调控因子，处于基因表达调控的中心位置。不同家族miRNAs在植物体内的差异表达显著，它们或广泛表达，或仅在特异的组织表达，或在特定的发育时期表达；并且，在不同层次上（转录、转录后、翻译等）对靶基因进行调控。烟草是一种重要的经济作物，打顶是烟草栽培种的一种重要农艺措施，烟株打顶后烟碱合成能力增强的原因一直是烟草科技工作者致力研究的焦点问题。为了研究烟株打顶后，根系合成烟碱能力变化的调控机制，我们采用对打顶前、后烟株根尖组织中的miRNAs进行了深度测序，获得了相应的表达谱。本文利用生物信息学方法对其表达谱进行了分析，同时分析了与烟碱合成相关的氮素代谢关键酶GS2，结果如下：
　　 1、将测序得到的小分子RNA(SmallRNA，sRNA)序列进行分类注释，获得样品中包含的各组分及表达量信息，经过样品间公共序列分析，在宏观上显示了烟草smallRNA的特征及表达变化。打顶前后小分子RNA序列核苷酸长度分布情况显示，打顶前、后均发现3个峰值，分别在21nt22nt和24nt处，这与smallRNA现有的研究发现相吻合，在打顶后，长度短于20个核苷酸的smallRNA数量要多于打顶前，而在打顶前，长度大于等于20个核苷酸的smallRNA数量要多于打顶后，并且打顶前24nt的smallRNA数量要高于打顶后smallRNA数量的30％。样品间共有序列在总smallRNA表达数量中占到了60.96％，但是在非冗余分布中占9.56％，这说明共有smallRNA序列是调控烟株正常生长发育过程的基础smallRNA。无论打顶前、后，rRNA和tRNA始终占除miRNA外4种非编码小RNA总量的99％，snRNA和snoRNA所占的比例不足1％;打顶前rRNA的含量高于tRNA，打顶后则相反。这种现象可能与rRNA、tRNA参与蛋白质合成步骤有关。
　　 2、找到和miRBase完全匹配的miRNA数量246条；打顶后表达量明显上升的miRNA12条，其中有8条表达量升高20倍以上，最高的达到了4500多倍；打顶后表达量明显下降的miRNA12条，有7条miRNA表达量不足打顶前的25％，下降幅度最大的miRNA表达量不足打顶前1％;打顶后表达量无明显变化的有9条；打顶前特异miRNA4条，打顶后特异miRNA4条；利用生物信息学方法，把那些在数据库中没有任何注释的小分子RNA根据miRNA候选发夹状结构的上游高度保守的模序、酶切位点的保守性、发夹前体折叠自由能能量等结构特征进行了预测和搜索，并分析其二级结构特征，发现烟草中未报道的miRNA的候选分子56个。
　　 3、电子克隆了miRNA164的靶基因：经网上资料查询，得到miRNA164的靶基因NAC，采用电子克隆方法得到了烟草中NAC-like基因的cDNA序列(1348bp)。并经过RT-PCR及测序鉴定，确定其为烟草中NAC转录子基因。
　　 4、预测、并分析了不同烟草品种中谷氨酰胺合成酶(glutaminesynthetase，GS)。烟草GS2未剪切肽链的Ser97位点附近预测到14-3-3蛋白的结合位点，可能具有和苜蓿中GS2相似的翻译后调控方式。烟草GS2成熟肽上均预测到MAPK和PKD的磷酸化位点，在Na、Ns两种烟草GS2和拟南芥GS2中预测到含有Spc24domain，表明NaGS2和NsGS2可能参与叶绿体的发育过程。