基于miR167的miRNA靶基因模拟物、基因表达盒、表达载体及应用

摘要

本发明公开了一种基于miR167的miRNA靶基因模拟物、基因表达盒、表达载体及应用，属于植物生物技术领域。本发明构建了胚乳特异性启动子Gt13a驱动靶基因模拟物和随机靶片段模拟物低表达miR167的双元载体，利用农杆菌浸染水稻胚性愈伤组织，经过筛选、分化得到转基因阳性植株，通过对转基因植株籽粒产量相关的表型进行鉴定，表明各转基因株系胚乳中miR167的表达量均显著下调，且各转基因株系成熟期糙米的千粒重、粒长、粒宽和粒厚均得到明显提高。

说明书

技术领域

本发明涉及一种基于miR167的miRNA靶基因模拟物，同时还涉及包含该miRNA靶 基因模拟物的基因表达盒、表达载体及应用，属于植物生物技术领域。

背景技术

粮食短缺是本世纪最严重的全球性问题之一，为了满足由于人口迅速增长而不断扩大 的粮食需求，世界粮食总产量到2050年需要增加70％(Tester and Langridge,2010)，中国 粮食总产量到2033年需要提高35％(Zhang,2011)。水稻作为最重要的粮食作物之一，世 界人口所需能量的21％，东南亚人口所需能量的76％均来自水稻(Fitzgerald et al.,2009)。 因此，提高水稻的产量和改善稻米品质具有重要的战略意义。

miRNA是广泛存在于真核生物中的一种19-24个碱基的非编码蛋白质的小分子RNA， 在转录后水平上通过碱基互补配对原则剪切或翻译抑制其靶基因的表达，在调节植物的生 长发育、逆境响应、激素稳态、器官的形态建成等过程中具有重要的作用(Chen,2009)。 水稻籽粒的生长发育需要协调籽粒内部各组织的生理生化代谢过程，且种子的形成又与植 物的繁衍息息相关，因此miRNAs可能也参与种子的生长发育。Zhu等(Zhu et al.,2008) 以受精后1-5d和6-10d的水稻籽粒为研究对象，鉴定出39个新的、不保守的miRNA，且 多数miRNA在受精后6-10d的表达量高于受精后1-5d的。Xue等(Xue et al.,2009)利用 大规模平行测序技术研究了miRNA在水稻籽粒发育过程中的作用，鉴定出26个新的和12 个候选的miRNA，并预测miR397等miRNA参与调控水稻籽粒的生长发育。Lan等(Lan  et al.,2012)在籼稻籽粒发育过程中鉴定21个保守的和91个不保守的miRNA家族，其中 有50％左右miRNA的表达量随籽粒的发育进程呈逐渐增加的变化趋势，而另一半随籽粒 的发育进程呈逐渐减小的变化趋势。Yi等(Yi et al.,2013)在水稻籽粒发育过程中鉴定了 434个已知的miRNA，其中有162个差异性表达，且大部分miRNA的表达量在籽粒受精 后5-7天随籽粒的发育进程呈逐渐升高的变化趋势。综上所述，miRNA可能在水稻籽粒发 育中具有重要的调节作用。

近年来，申请人以强势粒和弱势粒充实度差异较大的常规粳稻品种新丰2号为研究材 料，用大规模平行测序技术Solexa对灌浆充实不同时期的强、弱势粒miRNA进行了测序， 发现大多数miRNA随强、弱势粒的灌浆进程呈逐渐增加的变化趋势，且这些miRNA中的 大部分的表达量在强势粒中显著高于弱势粒。通过生物信息学分析证明这些差异表达 miRNA可能通过调控靶基因，对水稻的内源激素、细胞分裂、淀粉合成及信号转导等进行 调控，表明miRNAs表达量低可能是弱势粒灌浆充实度差，最终粒重低的一个原因(Peng  et al.,2011；Peng et al.,2014)。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于miR167的miRNA靶基因模拟物。

其次，本发明还提供一种包含上述miRNA靶基因模拟物的基因表达盒。

再次，本发明还提供一种包含上述miRNA靶基因模拟物或基因表达盒的表达载体。

最后，本发明还提供一种上述miRNA靶基因模拟物、基因表达盒或表达载体在培育 (高产)水稻品系及提高水稻产量中的应用。

为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是：

基于miR167的miRNA靶基因模拟物，具体为miR167靶基因模拟物或miR167随机 靶片段模拟物，miR167靶基因模拟物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，miR167随机靶 片段模拟物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

SEQ ID NO.1：

5’-GGTACC^(KpnI)TCTACTAAGGCAGATCATGCTCAA^(insertion)GGCAGCTTCAATTATTCG GTGGATCC^(BamHI)-3’。斜体部分为OsIPS1的骨架结构，下划线部分为miR167的结合位点。

SEQ ID NO.2：

5’-GGTACC^(KpnI)TAGATCATGCTCTA^(insertion)GGCAGCTTCAGTTGTTGTTGTTATGGT CTAATTTAAATATGGTCTAAAGAAGAAGAAT^(Spacer)CAGATCATGCTCTA^(insertion)GGCAGCTTCAGGATCC^(BamHI)-3’。下划线部分为miR167的结合位点。

基因表达盒，包含miR167靶基因模拟物的核苷酸序列(如SEQ ID NO.1所示)或 miR167随机靶片段模拟物的核苷酸序列(如SEQ ID NO.2所示)。基因表达盒还可以包含 Gt13a启动子基因序列和NOS终止子基因序列，Gt13a启动子基因序列如SEQ ID NO.3所 示，NOS终止子基因序列如SEQ ID NO.4所示。

SEQ ID NO.3：

5’-GAATTC^(EcoRI)TGAGTAATGTGTGAGCATTATGGGACCACGAAATAAAAAAAGA ACATTTTTATGAGCAGTGTGTTCTCAATGAGCCTTGAATGTTATCACCCAGGATAAGA AACCCTTAAGCAATGAAACATGCAAGCGTTTAATGTGCAAAGTTGGCATTCTCCACG ACATAATGCAAAAGAAGATATAATCTATGACATAGCAAGTCATGCATCATTTCATGCCT CTGTCAACCTATTCATTTCTAGTCATCTAGGTAAGTATCTTAAGCTAAAGTGTTAGAAC TTCCCATACATAAGTCATAACTGATGACAATTGGGTGTAACACATGACAAACCAGAGA GTCAAGCAAGATAAAGCAAAAGGATGTGTACATAAAACTACAGAGCTATATGTCATGT TGCGAAAAGAGGAGAGCTTATAAGACAAGCCATGACTCAAAAAAAATTCACATGCCT ACTGTGGCCCATATATCATGCAACAATCCAAAAACTCACAGGTCTCGGTGTTGATCGT GTCAACATGTGACCACCCTAAAAACTCTTCACTAAATATTAAAGTATTGCTAGAACAG AGCTTCAAGATATAAGTCATGATCACCAACAACCATGTTCAAAAAGAAATAGAAAGCT ATGGCACAGCAACAAAAAGCAAAAGCATGCATGGATATAATCTTTAACATCATCCATG TCATATTGCAAAAGAAAGAAAGAGAGAACAATACAAATGATGTGTCAATTACACATC CATCATTATCCATCCACCTTCCGTGTACCACACTTCATATATCATGAGTCACTTCATGTC TGGACATTAACAAACTCTATCTTAACATTCAAATGCATGAGACTTTATCTCACTATAAA TGCACAATGATTTAGCATTGTTTCTCACAAAACCATTCAAGTTCATTAGTACTACAACA AC^{(Gt13a promoter)}GAGCTC^(SacI)-3’。

SEQ ID NO.4：

5’-CTGCAG^(PstI)CGTTCAAACATTTGGCAATAAAGTTTCTTAAGATTGAATCCTGTT GCCGGTCTTGCGATGATTATCATATAATTTCTGTTGAATTACGTTAAGCATGTAATAATT AACATGTAATGCATGACGTTATTTATGAGATGGGTTTTTATGATTAGAGTCCCGCAATTA TACATTTAATACGCGATAGAAAACAAAATATAGCGCGCAAACTAGGATAAATTATCGC GCGCGGTGTCATCTATGTTACTAGATCGGG^{(NOS terminator)}AAGCTT^(HindIII)-3’。

具体的，基于miR167靶基因模拟物的基因表达盒的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示， 基于miR167随机靶片段模拟物的基因表达盒的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

SEQ ID NO.5：

5’-GAATTC^(EcoRI)TGAGTAATGTGTGAGCATTATGGGACCACGAAATAAAAAAAGA ACATTTTTATGAGCAGTGTGTTCTCAATGAGCCTTGAATGTTATCACCCAGGATAAGA AACCCTTAAGCAATGAAACATGCAAGCGTTTAATGTGCAAAGTTGGCATTCTCCACG ACATAATGCAAAAGAAGATATAATCTATGACATAGCAAGTCATGCATCATTTCATGCCT CTGTCAACCTATTCATTTCTAGTCATCTAGGTAAGTATCTTAAGCTAAAGTGTTAGAAC TTCCCATACATAAGTCATAACTGATGACAATTGGGTGTAACACATGACAAACCAGAGA GTCAAGCAAGATAAAGCAAAAGGATGTGTACATAAAACTACAGAGCTATATGTCATGT TGCGAAAAGAGGAGAGCTTATAAGACAAGCCATGACTCAAAAAAAATTCACATGCCT ACTGTGGCCCATATATCATGCAACAATCCAAAAACTCACAGGTCTCGGTGTTGATCGT GTCAACATGTGACCACCCTAAAAACTCTTCACTAAATATTAAAGTATTGCTAGAACAG AGCTTCAAGATATAAGTCATGATCACCAACAACCATGTTCAAAAAGAAATAGAAAGCT ATGGCACAGCAACAAAAAGCAAAAGCATGCATGGATATAATCTTTAACATCATCCATG TCATATTGCAAAAGAAAGAAAGAGAGAACAATACAAATGATGTGTCAATTACACATC CATCATTATCCATCCACCTTCCGTGTACCACACTTCATATATCATGAGTCACTTCATGTC TGGACATTAACAAACTCTATCTTAACATTCAAATGCATGAGACTTTATCTCACTATAAA TGCACAATGATTTAGCATTGTTTCTCACAAAACCATTCAAGTTCATTAGTACTACAACA AC^{(Gt13a promoter)}GAGCTC^(SacI)GGTACC^(KpnI)TCTACTAAGGCAGATCATGCTCAA^(insertion)GGCAGCTTCAATTATTCGGT^(MIM167)GGATCC^(BamHI)TCTAGA^(XbaI)GTCGAC^(SalI)CTGCAG^(PstI)CGTTCAAA CATTTGGCAATAAAGTTTCTTAAGATTGAATCCTGTTGCCGGTCTTGCGATGATTATCA TATAATTTCTGTTGAATTACGTTAAGCATGTAATAATTAACATGTAATGCATGACGTTAT TTATGAGATGGGTTTTTATGATTAGAGTCCCGCAATTATACATTTAATACGCGATAGAAA ACAAAATATAGCGCGCAAACTAGGATAAATTATCGCGCGCGGTGTCATCTATGTTACTA GATCGGG^{(NOS terminator)}AAGCTT^(HindIII)-3’。

SEQ ID NO.6：

5’-GAATTC^(EcoRI)TGAGTAATGTGTGAGCATTATGGGACCACGAAATAAAAAAAGA ACATTTTTATGAGCAGTGTGTTCTCAATGAGCCTTGAATGTTATCACCCAGGATAAGA AACCCTTAAGCAATGAAACATGCAAGCGTTTAATGTGCAAAGTTGGCATTCTCCACG ACATAATGCAAAAGAAGATATAATCTATGACATAGCAAGTCATGCATCATTTCATGCCT CTGTCAACCTATTCATTTCTAGTCATCTAGGTAAGTATCTTAAGCTAAAGTGTTAGAAC TTCCCATACATAAGTCATAACTGATGACAATTGGGTGTAACACATGACAAACCAGAGA GTCAAGCAAGATAAAGCAAAAGGATGTGTACATAAAACTACAGAGCTATATGTCATGT TGCGAAAAGAGGAGAGCTTATAAGACAAGCCATGACTCAAAAAAAATTCACATGCCT ACTGTGGCCCATATATCATGCAACAATCCAAAAACTCACAGGTCTCGGTGTTGATCGT GTCAACATGTGACCACCCTAAAAACTCTTCACTAAATATTAAAGTATTGCTAGAACAG AGCTTCAAGATATAAGTCATGATCACCAACAACCATGTTCAAAAAGAAATAGAAAGCT ATGGCACAGCAACAAAAAGCAAAAGCATGCATGGATATAATCTTTAACATCATCCATG TCATATTGCAAAAGAAAGAAAGAGAGAACAATACAAATGATGTGTCAATTACACATC CATCATTATCCATCCACCTTCCGTGTACCACACTTCATATATCATGAGTCACTTCATGTC TGGACATTAACAAACTCTATCTTAACATTCAAATGCATGAGACTTTATCTCACTATAAA TGCACAATGATTTAGCATTGTTTCTCACAAAACCATTCAAGTTCATTAGTACTACAACA AC^{(Gt13a promoter)}GAGCTC^(SacI)GGTACC^(KpnI)TAGATCATGCTCTA^(insertion)GGCAGCTTCAGTTGTTGTT GTTATGGTCTAATTTAAATATGGTCTAAAGAAGAAGAAT^(Spacer)CAGATCATGCTCTA^(insertion)GGCAGCTTCAGGATCC^(BamHI)TCTAGA^(XbaI)GTCGAC^(SalI)CTGCAG^(PstI)CGTTCAAACAT TTGGCAATAAAGTTTCTTAAGATTGAATCCTGTTGCCGGTCTTGCGATGATTATCATAT AATTTCTGTTGAATTACGTTAAGCATGTAATAATTAACATGTAATGCATGACGTTATTTA TGAGATGGGTTTTTATGATTAGAGTCCCGCAATTATACATTTAATACGCGATAGAAAAC AAAATATAGCGCGCAAACTAGGATAAATTATCGCGCGCGGTGTCATCTATGTTACTAGA TCGGG^{(NOS terminator)}AAGCTT^(HindIII)-3’。

表达载体，包含miR167靶基因模拟物的核苷酸序列(如SEQ ID NO.1所示)或miR167 随机靶片段模拟物的核苷酸序列(如SEQ ID NO.2所示)。表达载体还可以包含Gt13a启 动子基因序列(如SEQ ID NO.3所示)和NOS终止子基因序列(如SEQ ID NO.4所示)。

具体的，表达载体包含基于miR167靶基因模拟物的基因表达盒的核苷酸序列(如SEQ  ID NO.5所示)或基于miR167随机靶片段模拟物的基因表达盒的核苷酸序列(如SEQ ID  NO.6所示)。表达载体还可以包含载体pCAMBIA1302的核苷酸序列(NCBI Accession NO. AF234298)。例如，表达载体包含双元表达载体pCAMBIA1302-Gt13a-NOS的核苷酸序列， 双元表达载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。

更具体的，基于miR167靶基因模拟物的表达载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示， 基于miR167随机靶片段模拟物的表达载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。

miRNA靶基因模拟物在培育(高产)水稻品系及提高水稻产量中的应用。其中，miRNA 靶基因模拟物为miR167靶基因模拟物(如SEQ ID NO.1所示)或miR167随机靶片段模 拟物(如SEQ ID NO.2所示)。

基因表达盒在培育(高产)水稻品系及提高水稻产量中的应用。其中，基因表达盒包 含miR167靶基因模拟物的核苷酸序列(如SEQ ID NO.1所示)或miR167随机靶片段模 拟物的核苷酸序列(如SEQ ID NO.2所示)。基因表达盒还可以包含Gt13a启动子基因序 列(如SEQ ID NO.3所示)和NOS终止子基因序列(如SEQ ID NO.4所示)。具体的，基 于miR167靶基因模拟物的基因表达盒的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，基于miR167 随机靶片段模拟物的基因表达盒的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

表达载体在培育(高产)水稻品系及提高水稻产量中的应用。其中，表达载体包含 miR167靶基因模拟物的核苷酸序列(如SEQ ID NO.1所示)或miR167随机靶片段模拟物 的核苷酸序列(如SEQ ID NO.2所示)。表达载体还可以包含Gt13a启动子基因序列(如 SEQ ID NO.3所示)和NOS终止子基因序列(如SEQ ID NO.4所示)。具体的，表达载体 包含基于miR167靶基因模拟物的基因表达盒的核苷酸序列(如SEQ ID NO.5所示)或基 于miR167随机靶片段模拟物的基因表达盒的核苷酸序列(如SEQ ID NO.6所示)。表达载 体还可以包含表达载体pCAMBIA1302的核苷酸序列(NCBI Accession NO.AF234298)。 例如，表达载体包含双元表达载体pCAMBIA1302-Gt13a-NOS的核苷酸序列(如SEQ ID  NO.7所示)。更具体的，基于miR167靶基因模拟物的表达载体的核苷酸序列如SEQ ID  NO.8所示，基于miR167随机靶片段模拟物的表达载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。

上述表达载体在培育(高产)水稻品系及提高水稻产量中的应用，包括以下步骤：取 表达载体转化农杆菌，浸染水稻愈伤组织，共培养后经筛选、分化后鉴定转基因阳性植株； 鉴定采用的引物序列如下所示：

Gt13a VF：5’-TATCCATCCACCTTCCGTGT-3’(如SEQ ID NO.12所示)，

Gt13a VR：5’-GCAACAGGATTCAATCTTAA-3’(如SEQ ID NO.13所示)。

本发明的有益效果：

通过分析水稻籽粒灌浆进程中miR167在水稻强弱势粒中的变化动态和表达差异，发 现在籽粒灌浆过程中，强势籽粒miR167的表达量呈逐渐增加的变化趋势，弱势粒miR167 的表达量呈先降低后增加的变化趋势，与水稻强、弱势粒的灌浆速率呈负相关关系，且 miR167在强、弱势粒中差异性表达，其中miR167d、f-h、j在花后10天、15天和21天中 强势粒的表达丰度分别是弱势粒的2.96、9.38和4.23倍，表明miR167在水稻籽粒灌浆过 程中调节水稻籽粒的灌浆充实，进而决定水稻籽粒的大小。

为进一步验证miR167与水稻籽粒大小的关系，本发明构建胚乳特异性启动子Gt13a 驱动靶基因模拟物(Taget Mimic,MIM)和随机靶片段模拟物(Short Tandem Target Mimic, STTM)低表达miR167的双元载体，利用农杆菌浸染水稻胚性愈伤组织，经过筛选、分化 得到转基因阳性植株，通过对转基因植株籽粒产量相关的表型进行鉴定，结果表明：各转 基因株系胚乳中miR167的表达量均显著下调，且各转基因株系成熟期糙米的千粒重、粒 长、粒宽和粒厚均得到明显提高。

本发明针对当前人口不断增长和粮食需求不断增加的现状，利用miRNA在调节水稻 产量性状的作用，探讨miRNA在水稻品种改良中的功能，从而提供miR167在培育高产水 稻，特别是通过增加千粒重，进而增加产量中的应用。与现有技术相比具有以下特点：由 于低表达miR167可以显著增大水稻籽粒的大小和千粒重，本发明中基于miR167的miRNA 靶基因模拟物、基因表达盒、表达载体可以为培育高产水稻新品系提供一种简单有效的技 术手段，有利于大规模推广使用；本发明利用分子改良技术培育高产水稻，不但可以提高 水稻的产量，而且不会对环境造成污染，食用安全。

附图说明

图1为本发明实施例1中miR167靶基因模拟物(MIM167)的设计图；

图2为实施例2中miR167随机靶片段模拟物(STTM167)的设计图；

图3为实施例9中MIM167和STTM167转基因株系花后10天胚乳中miR167的表达 量分析图；

图4为实施例10中野生型对照、MIM167和STTM167转基因株系成熟期糙米外观比 较图；

图5为野生型对照、MIM167和STTM167转基因株系糙米千粒重的差异分析图；

图6为野生型对照、MIM167和STTM167转基因株系糙米粒长的差异分析图；

图7为野生型对照、MIM167和STTM167转基因株系糙米粒宽的差异分析图；

图8为野生型对照、MIM167和STTM167转基因株系糙米粒厚的差异分析图。

具体实施方式

下述实施例仅对本发明作进一步详细说明，但不构成对本发明的任何限制。

实施例1

miR167靶基因模拟物(MIM167)的设计：

从miRNA数据库miRBase(http://www.mirbase.org/index.shtml)中下载miR167的成 熟miRNA序列，Accession number为MIMAT0000641(osa-miR167a-5p)、IMAT0000642 (osa-miR167b-5p)、MIMAT0000643(osa-miR167c-5p)、MIMAT0001039(osa-miR167d-5p)、 MIMAT0001040(osa-miR167e-5p)、MIMAT0001041(osa-miR167f)、MIMAT0001042 (osa-miR167g)、MIMAT0001043(osa-miR167h-5p)、MIMAT0001044(osa-miR167i-5p) 和MIMAT0001086(osa-miR167j)，按照Franco-Zorrilla等(Nature genetics,2007)发明的 靶基因模拟物(MIM)设计MIM167，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。靶基因模拟物 与miR167序列互补，但模拟物在miR167自5’端第10位碱基与第11位碱基之间的位置 插入3个碱基，从而造成miR167与模拟物匹配时在第10位碱基与第11位碱基之间形成 一个突起。MIM167的构建参照Todesco等(PLoS genetics,2010)的方法以水稻OsIPSI 为模板，设计两条互补配对含有BamHI和KpnI粘性末端的寡聚核苷酸引物，引物Ⅰ的核 苷酸序列如SEQ ID NO.10所示，引物Ⅱ的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。miR167靶 基因模拟物(MIM167)的设计图见图1。

miR167靶基因模拟物的制备，包括以下步骤：

(1)根据miRNA数据库miRBase中miR167的成熟miRNA序列，设计两条互补配 对(含有BamHI和KpnI粘性末端)的寡聚核苷酸引物(引物Ⅰ和引物Ⅱ)，引物Ⅰ的核 苷酸序列如SEQ ID NO.10所示，引物Ⅱ的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示；

SEQ ID NO.10：

5’-CTCTACTAAGGCAGATCATGCTCAA^(insertion)GGCAGCTTCAATTATTCGGTG-3’，斜 体部分为OsIPSI的骨架结构，下划线部分为miR167的结合位点，加粗部分为KpnI和 BamHI酶切位点粘性末端序列；

SEQ ID NO.11：

5’-GATCCACCGAATAATTGAAGCTGCCTTG^(insertion)AGCATGATCTGCCTTAGTAGAG GTAC-3’，斜体部分为OsIPSI的骨架结构，下划线部分为miR167的结合位点，加粗部分 为KpnI和BamHI酶切位点粘性末端序列；

(2)引物Ⅰ和引物Ⅱ(由上海生工生物工程有限公司合成)稀释至10μMol/L，等体 积混合后置于PCR仪中，95℃10min后缓慢降至室温，至于冰上待用，产物即为含有KpnI 和BamHI酶切位点粘性末端的miR167靶基因模拟物(如SEQ ID NO.1所示)。

实施例2

miR167随机靶片段模拟物(STTM167)的设计：

从miRNA数据库miRBase(http://www.mirbase.org/index.shtml)中下载miR167的成 熟miRNA序列，Accession number为MIMAT0000641(osa-miR167a-5p)、IMAT0000642 (osa-miR167b-5p)、MIMAT0000643(osa-miR167c-5p)、MIMAT0001039(osa-miR167d-5p)、 MIMAT0001040(osa-miR167e-5p)、MIMAT0001041(osa-miR167f)、MIMAT0001042 (osa-miR167g)、MIMAT0001043(osa-miR167h-5p)、MIMAT0001044(osa-miR167i-5p) 和MIMAT0001086(osa-miR167j)，参照Yan等(The Plant cell,2012)发明的随机靶片段 模拟物(STTM)设计STTM167，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。靶基因模拟物与 miR167序列互补，但模拟物在miR167自5’端第10位碱基与第11位碱基之间的位置插入 3个碱基，从而造成miR167与模拟物匹配时在第10位碱基与第11位碱基之间形成一个突 起。两个靶基因模拟物以串联方式排列，两者中间加48nt的中间序列。miR167随机靶片 段模拟物(STTM167)的设计图见图2。

miR167随机靶片段模拟物的制备，包括以下步骤：

(1)根据miR167的序列设计一段miR167随机靶片段模拟物，其由两个靶基因模拟 物和一个48nt的中间序列组成，靶基因模拟物与miR167序列互补，但模拟物在miR167 自5’端第10位碱基与第11位碱基之间的位置插入3个碱基，从而造成miR167与模拟物 匹配时在第10位碱基与第11位碱基之间形成一个突起。两个靶基因模拟物以串联方式排 列，两者中间加48nt的中间序列，其结构和序列如图2及SEQ ID NO.2所示；

(2)在随机靶片段模拟物的5’端和3’端分别添加KpnI和BamHI酶切位点,，送往上 海生工生物工程有限公司进行合成。

实施例3

基于miR167靶基因模拟物的表达载体的制备，包括以下步骤：

(1)采用KpnI和BamHI对pCAMBIA1302-Gt13a-Nos载体进行双酶切，然后利用天 根DNA纯化回收试剂盒进行纯化回收；

(2)将实施例1中含有KpnI和BamHI酶切位点粘性末端的miR167靶基因模拟物加 入KpnI和BamHI双酶切后的pCAMBIA1302-Gt13a-Nos载体中，4℃连接过夜；

(3)连接产物转化至DH5ɑ感受态细胞，并在含有50mg/L的卡那霉素平板上，37℃ 倒置培养16h；

(4)菌落PCR初步验证后，送往上海生工生物工程有限公司进行测序验证，序列如 SEQ ID NO.8。

pCAMBIA1302-Gt13a-Nos载体的构建方法与公布号CN103710341A的发明专利中 pCAMBIA1301-Gt13a-Nos载体的构建方法基本相同，唯一不同的是本发明中构建 pCAMBIA1302-Gt13a-Nos载体采用pCAMBIA1302原始载体，而专利文献中采用的是 pCAMBIA1301。

实施例4

基于miR167随机靶片段模拟物的表达载体的制备，包括以下步骤：

(1)采用KpnI和BamHI对pCAMBIA1302-Gt13a-Nos载体进行双酶切，然后利用天 根DNA纯化回收试剂盒进行纯化回收；

(2)采用KpnI和BamHI对实施例2中人工合成的miR167随机靶片段模拟物进行双 酶切，然后利用天根DNA纯化回收试剂盒进行纯化回收；

(3)酶切产物的连接：将miR167随机靶片段靶基因模拟物KpnI和BamHI酶切产物 加入到KpnI和BamHI双酶切后的pCAMBIA1302-Gt13a-Nos载体中，4℃连接过夜；

(4)连接产物转化至DH5ɑ感受态细胞，并在含有50mg/L的卡那霉素平板上，37℃ 倒置培养16h；

(5)菌落PCR初步验证后，送往上海生工生物工程有限公司进行测序验证，序列如 SEQ ID NO.9。

实施例5

基于miRNA靶基因模拟物的表达载体转化水稻品种日本晴，包括以下步骤：

1、pCAMBIA1302-Gt13a-MIM167-NOS和pCAMBIA1302-Gt13a-STTM167-NOS转化 农杆菌EHA105菌株

(1)两种表达载体分别取1μg加到200μl冰上溶化的农杆菌感受态细胞中，轻混，冰 浴30min，液氮中速冻5min，37℃水浴5min，再迅速冰浴2min；

(2)加入800μl LB液体培养基(不含抗生素)，28℃轻摇5h(4～6h均可)；

(3)菌体离心，除去上清液，剩余菌体重悬后涂布于YM选择平板上(Kan 50mg/L， Rif 50mg/L，见下表1)，28℃倒置培养2天。

表1 YM培养基成分

2、浸染水稻愈伤组织，转基因阳性植株筛选、分化和鉴定方法：

(1)去壳水稻种子用70％乙醇表面消毒3min(2～4min均可)，灭菌水清洗2次，剧 烈摇动；

(2)用有效氯浓度1.5％次氯酸钠(加1滴吐温)消毒30min，消毒后用灭菌水清洗5 次(5～6次均可)；

(3)种子置于2N6培养基上(见下表2)，28℃暗培养4周半(4～5周均可)；

(4)挑取淡黄色、颗粒状的愈伤组织，转移到新的2N6培养基上预培养6天(5～7 天均可)后侵染；

(5)挑取含目的质粒的农杆菌单菌落，500μl YM液体培养基(50mg/L Kan，50mg/L  Rif)摇菌36h(24～48h均可)至菌体浑浊，即用或置于4℃保存；

(6)将第一次摇菌保存的农杆菌接种于YM液体培养基(50mg/L Kan，50mg/L Rif) 中，三角瓶中摇菌过夜，培养至OD600达到0.9(0.8～1.0均可)，加入30μl AS(100mM) 后室温放置2h(2～3h均可)后直接用于愈伤侵染；

表2 2N6培养基成分

(7)将预培养后的愈伤浸入上述农杆菌菌液中，室温条件下放置15min，并不时摇动， 取出愈伤组织，在无菌纸上吸去多余的菌液，吹干，随即将愈伤组织转移到铺有一层无菌 滤纸的固体共培养基2N6-AS(见下表3)，23℃暗培养3天；

表3 2N6-AS培养基成分

(8)共培养后的愈伤先用灭菌水清洗，洗至上清液澄清，然后再用500mg/L羧苄青 霉素溶液浸泡10min，而后除去上清液，将愈伤置于灭菌干燥滤纸上吸干水分，更换滤纸， 超净台上继续风干30～60min(45min)，愈伤干燥后转移至2N6-S培养基(见下表4)上， 28℃暗培养，每2周继代一次，连续筛选3次；

表4 2N6-S筛选培养基成分

(9)将抗性愈伤转移至三角瓶中分化培养基N6-R(见下表5)上，28℃暗培养一周 后光照培养(16h光照/8h黑暗)，待分化小苗长至2.5厘米(2～3厘米均可)时将小苗转 至1/2MS生根培养基(见下表6)上生根；

表5 分化培养基N6-R成分

表6 1/2MS培养基成分

(10)待再生苗长出根系后，打开封口膜加入少量水(～1cm深)，炼苗4天(3～5 天均可)以后载入土钵中；

(11)将水稻幼苗叶片提取DNA，使用MIM167和STTM167两侧引物进行PCR阳 性鉴定，引物序列为：

Gt13a VF：5’-TATCCATCCACCTTCCGTGT-3’(如SEQ ID NO.12所示)，

Gt13a VR：5’-GCAACAGGATTCAATCTTAA-3’(如SEQ ID NO.13所示)。

试验例

转基因植株miR167表达量的检测：

miR167的表达量采用stem-loop qRT-PCR的方法进行测定。转基因植株和非转基因野 生型水稻花后10天胚乳总RNA的提取用RNA提取试剂盒进行，然后使用HiFi-MMLV  cDNA Kit反转录成cDNA，取5μl按1:20稀释的cDNA做模板，配置20μl含有10μl  UltraSYBR mixture反应体系，以β-actin为内参基因，在BioRad Iq5仪器上进行实时荧光 定量PCR，反应程序：95℃预保温10min，95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s， 40个循环。所有PCR均设置3次重复，相对表达量用2-△△Ct方法计算，结果见图3。 从图3可以看出，转基因植株MIM167和STTM167花后15天胚乳中miR167的表达量与 未转基因野生型植株相比明显下降。

转基因植株籽粒表型分析：

分别选取MIM167和STTM167转基因株系中miR167表达量降低的独立转基因株系， 对表达量降低的转基因株系糙米的粒重、粒长、粒宽和粒厚进行考种，平均值和标准误通 过20个重复实验获得，结果见图4-8。从图4-8可以看出，MIM167和STTM167低表达 miR167各转基因株系的籽粒千粒重、粒长、粒宽和粒厚均比未转基因野生型水稻对照明显 增加，且各转基因株系糙米千粒重增幅均在4.98％以上，其中STTM167-17糙米千粒重最 大，达到25.21g，比对照的20.63g增加4.58g，增幅达22.18％。