猪后腿肉中氨肽酶的分离纯化与酶学特性研究

摘要

氨肽酶是从蛋白质或肽链的氨基端选择性切割氨基酸残基的外肽酶，在肉类贮藏与加工过程中，对风味和营养物质的形成起着重要的作用。但国内对猪肉中主要氨肽酶的研究还比较少，本文以猪后腿肉为原料，对其中的亮氨酰氨肽酶、丙氨酰氨肽酶和精氨酰氨肽酶进行分离纯化，并对它们的一些酶学特性进行研究，为研究其对肌肉蛋白的水解能力及其在加工过程中的活力变化提供一定的理论基础。
　　本研究采用匀浆提取出粗酶液后，再通过硫酸铵分级沉淀、Sephadex G-100凝胶过滤和henyl-Sepharose HP疏水层析等过程，从猪后腿肉中分离纯化出高活力的丙氨酰氨肽酶、精氨酰氨肽酶和亮氨酰氨肽酶，对其进行生物化学性质的研究;确定了各个氨肽酶的最佳反应温度和pH值，然后研究了金属离子、EDTA和EGTA等对氨肽酶活性的影响;并对氨肽酶的水解反应进行了研究，确定了氨肽酶对七种小分子肽的活力和作用方式。
　　研究结果表明:亮氨酰氨肽酶的得率为12.14％，纯化了77.62倍;亮氨酰氨肽酶的最适温度为40℃左右，最适pH为7.0左右，Mg2+对酶活性有激活作用，Zn2+、Cu2+、Co2+、EDTA、EGTA对酶活性有抑制作用;Ca2+、Fe2+和Mn2+对亮氨酰氨肽酶活性的影响取决于离子浓度，浓度为0.5 mmol·L-1时对酶具有激活作用，而浓度为1.0 mmol·L-1时则表现为抑制作用。
　　丙氨酰氨肽酶纯化了36.52倍，并且酶的回收得率达到了10.34％;最佳反应温度在50℃左右，最佳反应pH值是在6.0左右;对于Zn2+和Fe2+来说，低浓度时的激活作用大于高浓度;Mg2+是随着添加离子浓度的升高其抑制作用越大;Mn2+和EGTA随着浓度增加，其抑制作用先升高后降低;Cu2+和EDTA对丙氨酰氨肽酶表现出强烈的抑制作用，其抑制强度随着浓度的增加而增人。
　　精氨酰氨肽酶的回收得率达到了10.94％，纯化了107.46倍;最适反应温度为50℃左右，最佳反应pH是6.0左右;Fe2+对精氨酰氨肽酶的活性有促进作用，且随着离子浓度的增加其激活促进越强，低浓度Mg2+抑制酶活性，高浓度激活酶活性;Mn2+对精氨酰氨肽酶表现为轻微的激活作用;Cu2+对精氨酰氨肽酶表现出了强烈的抑制作用，且随着浓度的增加其抑制作用越强。螯合剂EDTA表现出强烈的抑制作用，EGTA则表现为轻微的激活作川。
　　亮氨酰氨肽酶对Ala-His和Ala-Ala-Pro有水解能力，其活力不高，对Gly-Lys、Asp-His、Asn-Phe、Ser-Gly-Phe、Leu-Leu-Ala-His不水解;对Ala-Ala-Pro的水解产物Aia-Pro也有一定的水解能力。丙氨酰氨肽酶不能水解Gly-Lys、Asp-His、Asn-Phe、Leu-Leu-Ala-His，能够水解Ala-His、Ala-Ala-Pro和Ser-Gly-Phe，尤其对Ala-Ala-Pro的水解能力很高，活力达到99.5386U/mL，对其水解出来的二肽Ala-Pro也有很高的水解能力。精氨酰氨肽酶只水解Aia-His，且水解能力很小，对其它的小分子肽没有水解能力。

目录

声明

摘要

第一章 文献综述

1 氨肽酶的研究进展

1．1 氨肽酶的分布

1．2 氨肽酶的分类和命名

1．3 氨肽酶的生化特性

1．4 几种常见的氨肽酶

1．5 氨肽酶在食品中的应用

1．6 研究意义与研究内容

第二章：亮氨酰氨肽酶的分离纯化与酶学特性研究

1 引言

2 材料与方法

2．1 实验材料与试剂

2．2 主要仪器与设备

2．3 试验方法

2．4 数据处理

3 结果与分析

3．1 亮氨酸氨肽酶的硫酸铵沉淀

3．2 亮氨酰氨肽酶的Sephadex G-100凝胶过滤结果

3．3 Phenyl-Sepharose HP疏水层析

3．4 亮氨酰氨肽酶的分离纯化结果

3．5 亮氨酰氨肽酶的最适反应温度

3．6 亮氨酰氨肽酶的最适反应pH

3．7 金属离子和螯合剂对亮氨酰氨肽酶活性的影响

4 讨论

第三章：丙氨酰氨肽酶的分离纯化与酶学特性研究

1 引言

2 材料与方法

2．3 试验方法

2．4 数据处理

3 结果与分析

3．1 硫酸铵沉淀结果

3．2 丙氨酰氨肽酶SephadexG-100凝胶过滤结果

3．3 Phenyl-Sepharose HP疏水层析

3．4 丙氨酰氨肽酶的纯化结果

3．5 丙氨酰氨肽酶的最适反应温度

3．6 丙氨酰氨肽酶的最适pH

3．7 金属离子对丙氨酰氨肽酶活性的影响

3．8 EDTA和EGTA对酶活性的影晌

4 讨论

第四章：精氨酰氨肽酶的分离纯化与酶学特性研究

1 引言

2 材料与方法

2．1 主要实验材料、试剂和仪器

2．2 试验方法

2．3 精氨酰氨肽酶的分离纯化

2．4 数据处理

3 结果与分析

3．1 硫酸铵沉淀结果

3．2 SephadexG-100凝胶过滤

3．3 Phenyl-Sepharose HP疏水层析

3．4 精氨酰氨肽酶的分离纯化结果

3．5 精氨酰氨肽酶最适温度的测定

3．6 精氨酰氨肽酶的最适反应pH值

3．7 金属离子对精氨酰氨肽酶活性的影响

3．8 EDTA和EGTA对酶活性的影响

4 讨论

第五章 氨肽酶对金华火腿中小分子肽的水解研究

1 引言

2 材料与方法

2．1 实验材料与试剂

2．2 主要仪器与设备

2．3 试验方法

3 讨论与分析

第六章 结论与展望

1 结论

2 展望

参考文献

致谢