Fos12和Leptin基因的克隆及其在豫南黑猪不同组织内表达规律的研究

摘要

Fosl2(Fos-like antigen2)属于活化因子蛋白1(activator protein-1，AP1)转录因子家族中的一种，在多种组织中均有显著表达，对哺乳动物的生长发育、生殖性状、免疫应答等方面起到重要的作用。近年来，随着研究的深入，人们发现Fosl2基因与脂肪代谢、骨骼发育以及疾病和癌症的发生有着重要联系;Leptin基因是人们最早发现的调节能量代谢的基因。本研究在实验室前期工作的基础上，以豫南黑猪为试验材料，对Fosl2和Leptin进行克隆测序及生物学信息分析，研究了豫南黑猪在不同发育时期及不同组织中的发育差异性表达，以期探索Fosl2和Leptin在猪不同发育阶段中所起的作用，从基因角度阐明豫南黑猪的组织表达谱规律。根据NCBI中GenBank已经公布的人、鼠、牛和大猩猩Fosl2的mRNA序列，利用计算机软件DNAstar进行基因序列的同源性比对，找出不同物种之间Fosl2基因cDNA的保守区域后设计特异性引物，采用RT-PCR技术克隆基因，利用克隆的碱基序列作为探针在NCBI中进行同源性比对，利用生物信息学软件对两种基因的氨基酸结构和序列特征进行分析和预测，采用实时荧光定量PCR方法在mRNA水平上检测两种基因在豫南黑猪不同生长发育时期中的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、肌肉和背部脂肪组织中的表达变化和表达差异情况。通过上述方法得出如下试验结果:
　　1、根据不同物种比对后得到的保守区域，设计特异性引物，采用RT-PCR方法从豫南黑猪胎衣中扩增出Fosl2基因部分cDNA序列，从背部脂肪组织中扩增出Leptin基因部分cDNA序列，分别为1427 bp和253bp;其中Fosl2的CDS区域长度为984 bp。
　　2、根据1中所示方法在豫南黑猪的内脏器官中扩增该基因序列时，得到长度为770bp的Fosl2转录本。与胎衣中所得片段相比，该转录本第三外显子后端缺失44个碱基序列，在第四外显子的前端同样有碱基缺失，长度为614 bp。
　　3、利用生物学信息软件分析豫南黑猪Fosl2基因所得序列与Leptin基因的CDS与多种物种的同源一致性，结果显示:猪Fosl2基因序列与牛(NM_001192950.1)、人(BC022791.1)、猕猴(NM_001260911.1)、大猩猩(XM_004029036.1)、鼠(XM_004686333.1)、树鼩(XM_006162129.1)、马(XM_005600106.1)的核苷酸同源性分别为91％、89％、89％、89％、89％、88％、90％。而与上述物种的氨基酸一致性则分别为:85％、86％、84％、85％、82％、83％、71％。可见该基因在不同物种之间的保守性较高。Leptin基因与人(NM_000230.2)、牛(NM_173928.2)、鼠(NM_013076.3)、海豹(AJ618981.1)、海狮(AM157372.2)、犬(NM_001003070.1)、灰海豹(AJ618982.1)、小家鼠(NM_008493.3)、猕猴（NM_001042755.1）、家猫(NM_001009850.1)等物种核苷酸同源性分别为88％、92％、85％、83％、87％、92％、83％、85％、88％、91％，而与上述物种的氨基酸一致性分别为97％、100％、94％、89％、87％、90％、92％、94％、97％、92％，该基因在哺乳动物间的保守型同样较高。
　　4、通过实时荧光定量PCR技术检测到豫南黑猪Fosl2基因在多种组织内广泛表达，其中在7日龄、30日龄、60日龄和180日龄中肺脏组织中的相对表达含量虽有较大波动，但一直维持在最高的相对表达水平，其次是在脾脏组织内的相对表达含量。而Leptin基因在180日龄中的脂肪组织内相对表达含量最高。
　　5、两种基因在同一组织的不同发育时期的变化规律为:肺脏组织中Fosl2基因的mRNA变化幅度最大，7日龄肺脏、肾脏和脾脏内的相对表达含量为各个时期的最高值，30日龄的肌肉组织内相对表达含量最高，180日龄时心脏和背部脂肪内Fosl2基因的相对表达含量最高。Leptin基因在7日龄肾脏和肌肉内的相对表达量最高，而30日龄则是脾脏和肺脏的表达含量最高，心脏和肝脏的相对最高表达含量出现在60日龄时期，180日龄背部脂肪内的相对表达含量明显高于其他组织。
　　6、Fosl2基因和Leptin基因在背部脂肪组织不同时期的变化规律趋于一致:均为30日龄呈上升趋势，60日龄稍微下降，到达180日龄时，两个基因的mRNA相对表达量骤增，达到最高值。

目录

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致谢

摘要

第一部分 文献综述

1．1 Fosl2基因的研究进展及应用

1．1．1 Fosl2的基因定位与结构

1．1．2 Fosl2基因的组织表达分布

1．1．3 Fosl2的功能研究

1．1．4 展望

1．2 Fosl2基因与Leptin基因在脂肪代谢中的联系

1．3 Leptin基因的研究进展

1．3．1 Leptin的发现

1．3．2 Leptin基因的结构与定位

1．3．3 Leptin的功能

1．3．4 小结

1．4 实时荧光定量PCR技术

1．4．1 实时荧光定量PCR原理

1．4．2 荧光定量PCR的定量方法

1．4．3 实时荧光定量PCR技术的应用

第二部分 豫南黑猪Fosl2基因的克隆、生物学信息分析与组织表达

第一章 豫南黑猪Fosl2基因的克隆与生物信息分析

2．1 基因克隆试验材料

2．2 试验方法和步骤

2．3 结果

第二章 豫南黑猪Fosl2基因在不同组织以及不同时期的表达分析

2．4 材料与方法

2．5 结果与分析

2．6 讨论

2．7 小结

第三部分 豫南黑猪Leptin基因的克隆、生物学信息分析与组织表达

第一章 豫南黑猪Leptin基因的克隆与生物信息分析

3．1 基因克隆实验材料

3．2 材料与方法

3．3 结果

第二章 豫南黑猪Leptin基因在不同组织以及不同时期的表达分析

3．4 材料与方法

3．5 结果与分析

3．6 讨论

3．7 小结

第四部分 结论

第五部分 创新点及下一步的工作展望

参考文献