鸡志贺菌IpaC蛋白及其菌体灭活苗的免疫效果研究

摘要

志贺菌病是由志贺菌属细菌引起的一种肠道传染性腹泻，是夏秋季节最常见的肠道传染病之一。该病流行广泛，危害严重，可感染人及多种动物，引起发病甚至死亡，危害人类的健康，并给我国养殖业造成巨大的经济损失。因此，对该病的防治以及生物疫苗的研究不仅具有重要的兽医公共卫生学意义，而且具有重大的医学公共卫生学意义。本研究用鸡志贺菌IpaC蛋白、鸡志贺菌菌体灭活疫苗以及两者混合物作为免疫原分别免疫小鼠，对小鼠进行体液免疫和细胞免疫功能测定及攻毒免疫保护试验，取得了较好结果，为正确评价疫苗免疫效果，有效预防和控制该病提供了可靠的检测手段和方法。研究结果如下：
　　1、鸡志贺菌IpaC基因的克隆及表达
　　用PCR方法从重组质粒pMD18-T-IpaC中扩增出IpaC基因，将其克隆到表达载体pET32a中，构建了重组表达质粒pET32a-IpaC，并转化至大肠杆菌BL21（DE3）中，以IPTG为诱导剂进行诱导表达。SDS-PAGE结果表明成功表达了IpaC蛋白，在上清液和包涵体中均有表达，表达的融合蛋白分子量为63kD。上清液用Ni-Agarose His标签进行纯化至电泳纯，测定并调整蛋白浓度为1mg/mL。Western-blot分析表明该蛋白可被单抗所识别，具有良好的免疫反应原性。
　　2、鸡志贺菌IpaC蛋白和菌体灭活疫苗及其混合疫苗的体液免疫作用
　　进行体液免疫测定，首先制备三种不同的免疫原，分别为电泳纯的IpaC蛋白（浓度1mg/mL）、鸡志贺菌ZMD01株菌体灭活液（浓度1010cfu/mL）和二者1：1的混合液，将以上三种抗原分成两批，一批加弗氏完全佐剂用于首免，另一批加弗氏不完全佐剂用于二免加强免疫。首免后21d加强免疫，首免和二免各组均按小鼠皮下注射免疫0.2mL/只，并设PBS对照组。于不同时间采血进行抗体测定，首免和二免均于免疫后7d和14d断尾采血分离血清，用已建立的间接ELISA方法检测血清抗体效价。结果表明，各免疫组小鼠的抗体几何平均滴度（GMT）明显高于同期的对照组（P＜0.05），在二免后14d达到最高峰，IpaC蛋白组、灭活菌体组和二者混合组三个组的抗体平均滴度分别为1:15241、1:16591、1:18093，PBS对照组为1:20，三个免疫组间的差异不明显（P＞0.05），混合组GMT＞灭活菌体组GMT＞IpaC蛋白组GMT。
　　3、鸡志贺菌IpaC蛋白和菌体灭活疫苗及其混合疫苗的细胞免疫作用
　　进行细胞免疫测定，疫苗的种类、动物分组和免疫方法及采血时间同上述体液免疫测定。对二免后21d的各组小鼠用四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法（简称MTT法）检测脾脏淋巴细胞刺激指数（SI）、用流式细胞术检测外周血T淋巴细胞亚群比例、用山羊抗鼠ELISA检测试剂盒检测IL-2和IFN-γ的水平。结果表明，①二免后21d，各免疫组的淋巴细胞刺激指数均显著高于PBS对照组（P＜0.05），各免疫组间差异不显著（P＞0.05），混合组（2.241±0.243）略高于IpaC蛋白组（2.120±0.210），IpaC蛋白组又略高于灭活菌体组（2.085±0.185）。②T淋巴细胞亚群分析表明，各免疫组的CD3+、CD4+的比例均略高于PBS对照组，而CD8+的比例略小于PBS对照组，IpaC蛋白组、灭活菌体组、混合组CD4+/CD8+的比值分别比PBS对照组高17.92％、26.27%、28.11%。③从首免7d开始，除了PBS对照组外，其他各组的IL-2和IFN-γ的含量逐步上升，到二免后21d与PBS对照组有了极显著的差异（P＜0.01），但是各免疫组间差异不显著（P＞0.05）。
　　4、攻毒免疫保护试验
　　首先测定菌株的半数致死量（LD50），用六个不同菌数的志贺菌ZMD01株感染剂量对小鼠进行攻毒，观察记录每个剂量的小鼠死亡数量，攻毒后7d统计死亡情况，用Bliss方法计算出志贺菌ZMD01株对小鼠的LD50。用LD50剂量对二免后21d各组的小鼠进行攻毒，观察记录各组小鼠的发病情况。结果显示，发病小鼠精神沉郁、食欲降低、粪便有异常。攻毒后7d各组小鼠存活率分别为：IpaC蛋白组5/10，灭活菌体组5/10，混合组6/10，PBS组3/10。剖检病变主要为肝脏肿大，呈红褐色，有出血；脾脏有出血并且肿大；肠道肿胀，肠壁变薄，有少量出血现象。在发病小鼠的肝脏、脾脏和肠内容物中均回收到病原菌。
　　结论：鸡志贺菌IpaC基因可进行原核有效表达，表达蛋白具有良好的免疫反应原性；鸡志贺菌IpaC蛋白和菌体灭活疫苗及其混合疫苗均具有良好的体液免疫和细胞免疫增强作用及较好的免疫保护作用，且混合疫苗的作用均高于其它两组，混合疫苗有望成为候选疫苗。

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中文摘要

1 文献综述

1.1 志贺菌的生物学特性

1.2 志贺菌的流行病学

1.3 志贺菌的致病性

1.4 志贺菌的致病机理

1.5 志贺菌的毒力相关基因

1.6 志贺菌病的免疫机制

1.7 志贺菌的检测方法

1.8 本研究的目的与意义

2 鸡志贺菌IpaC基因的克隆及表达

2.1 材料与方法

2.2 结果与分析

2.3 结论与讨论

3 鸡志贺菌IpaC蛋白和菌体灭活疫苗及其混合疫苗

3.1 材料与方法

3.2 结果与分析

3.3 结论与讨论

4 鸡志贺菌IpaC蛋白和菌体灭活疫苗及其混合疫苗

4.1 材料与方法

4.2 结果与分析

4.3 结论与讨论

5 鸡志贺菌IpaC蛋白和菌体灭活疫苗及其混合疫苗

5.1 材料与方法

5.2 结果与分析

5.3 结论与讨论

全文总结

参考文献

英文摘要

附录一 英文缩略词表

附录二 IpaC蛋白基因序列及其编码的核苷酸序列