环二核苷酸合成酶基因丙酸诱导型表达载体的构建及原核表达

摘要

环二核苷酸(Cyclic di-nucleotides)是目前发现的重要的第二信使分子。研究表明它们能传递多种细胞外的不同信息，调节大量不同的生理生化过程，如细菌的生物膜形成和宿主天然免疫应答，可用于免疫治疗、免疫预防或疫苗佐剂用于人和动物的临床研究。鉴于环二核苷酸的重要功能及其应用价值，本试验对10种环二核苷酸合成酶基因进行原核表达载体构建及体外诱导表达，以期为c-GAMP及c-di-GMP体外合成及疫苗佐剂研究奠定基础。
　　首先，本试验通过对10个不同物种来源的环二核苷酸合成酶基因及丙酸诱导型载体的多克隆位点的核苷酸序列进行分析，设计BamHⅠ和XhoⅠ两个限制性内切酶位点用于10个不同物种环二核苷酸合成酶丙酸诱导型载体构建;PCR扩增和酶切获取10个不同物种环二核苷酸合成酶基因的线性片段后，用T4连接酶将10个基因与相同双酶切处理的载体连接后转化至E.coli BL21(DE3);利用双酶切及测序的方法鉴定重组质粒;构建成功的重组质粒经丙酸钠诱导表达后，SDS-PAGE电泳鉴定重组蛋白的表达;对有重组蛋白表达的菌体超声破碎，取上清样品进行Western blot分析鉴定重组蛋白是否为可溶性表达。试验结果表明成功构建了10个不同物种的环二核苷酸合成酶基因的丙酸诱导型原核表达重组质粒，8个重组质粒在BL21中有表达且为可溶性表达。
　　其次，利用Ni-NTA Agarose亲和纯化霍乱弧菌环二核苷酸合成酶VC0179重组蛋白并用TEV酶切获取靶蛋白。体外酶促反应检测VC0179重组蛋白的功能活性，高效液相色谱检测体外合成产物。试验结果显示Ni-NTA Agarose纯化后获得了高纯度的VC0179重组蛋白，并且在TEV酶的作用下可将融合标签切除，获得VC0179靶蛋白;体外酶促反应证实该重组蛋白具有功能活性，可在体外一步法生成c-di-GMP。以上试验结果表明本试验为c-GAMP和c-di-GMP后续的体外合成及佐剂功能研究奠定了基础。

目录

声明

致谢

摘要

1 文献综述

1．1 c-di-GMP

1．2 c-GAMP

1．3 cGAS

1．4 丙酸诱导型原核表达系统

1．5 融合标签

1．5．1 His6亲和标签

1．5．2 Cherry可溶标签

1．6 TEV蛋白酶

1．7 展望

2 引言

3 材料与方法

3．1 试验材料

3．1．1 菌种和质粒

3．1．2 主要试剂

3．1．3 主要仪器

3．1．4 常规生化试剂的配制

3．2 试验方法

3．2．1 环二核苷酸合成酶基因线性片段的获取

3．2．2 丙酸诱导型载体线性片段的获取

3．2．3 pEX-环二核苷酸合成酶(pEX-cDNS)重组质粒的构建

3．2．4 重组质粒的鉴定

3．2．5 重组质粒的原核表达及鉴定

3．2．6 融合蛋白可溶性分析

3．2．7 霍乱弧菌环二核苷酸合成酶(VC0179)重组蛋白的纯化及功能活性分析

4 结果与分析

4．1 环二核苷酸合成酶基因线性片段的获取

4．2 pEX-环二核苷酸合成酶(pEX-cDNS)重组质粒的鉴定

4．2．1 双酶切鉴定

4．2．2 测序鉴定

4．3 重组质粒的原核表达及鉴定

4．4 融合蛋白可溶性分析

4．5 霍乱弧菌环二核苷酸合成酶(VC0179)重组蛋白的纯化及功能活性分析

4．5．1 霍乱弧菌环二核苷酸合成酶(VC0179)重组蛋白的纯化及TEV酶切

4．5．2 霍乱弧菌环二核苷酸合成酶(VC0179)体外功能活性分析

5 讨论与结论

5．1 讨论

5．2 结论

参考文献