鸭源鸡杆菌的生物被膜形成能力及对鸡原代输卵管上皮作用的初步研究

摘要

鸡杆菌属(Gallibacterium)是革兰氏阴性巴氏杆菌科中一个新属，代表种为鸭源鸡杆菌(Gallibacterium anatis，Ganatis)。鸭源鸡杆菌是构成鸡上呼吸道和下生殖道常在菌群的一部分，具有条件致病性，与蛋鸡输卵管炎、输卵管囊肿及腹膜炎等有关，引起鸡产蛋量下降和死亡。近年来国内外虽对鸭源鸡杆菌进行了系列研究，但关于鸭源鸡杆菌的体外生物被膜形成条件及其对鸡原代输卵管上皮细胞的作用尚未见报道。因此，为进一步揭示鸭源鸡杆菌引起鸡输卵管囊肿的相关机制，本研究拟探讨鸭源鸡杆菌的体外生物被膜形成条件和鸡原代输卵管上皮细胞的培养方法，并在此基础上研究鸭源鸡杆菌对鸡的致病性和相关黏附与侵袋特性，初步揭示鸭源鸡杆菌引起蛋鸡输卵管炎和腹膜炎的原因。
　　本文采用体外定量法检测20株鸭源鸡杆菌的被膜形成能力，并对被膜形成能力较强的1株鸭源鸡杆菌在不同条件（培养时间、培养基质、营养条件）下产生生物被膜(Bacterialbiofilm，BF)的差异进行了研究。结果显示，大部分鸭源鸡杆菌具有形成不同程度生物被膜的能力，其中3株被膜形成能力中等，2株形成能力较强;鸭源鸡杆菌在银染法、试管和96孔细胞培养板中形成BF的最佳培养时间分别是24 h、60 h和24 h。其生长周期为8h开始起始黏附、20 h大量黏附、24 h时形成完整的生物被膜、32 h生物被膜老化散播，之后起始新一轮的被膜形成周期。葡萄糖、蔗糖及NaCl均在一定程度上抑制了BF的形成，且随着浓度的增加，NaCl对被膜形成抑制更显著，而低浓度的MgSO4在一定程度上促进BF的形成。扫描电镜观察发现，生物被膜内的菌体聚集成团块状、相互黏连形成致密的三维立体结构。
　　为探讨鸡原代输卵管上皮细胞分离培养方法，进一步研究鸭源鸡杆菌对鸡的致病性和相关侵袭特性，分别对消化酶、消化时间、取材部位和表面包被物等条件进行比较和优化，筛选出鸡原代输卵管上皮细胞分离和纯化的最佳方法，并对培养细胞进行鉴定与传代。结果显示，取鸡输卵管漏斗部，并用0.25％胰酶+0.02％ EDTA联合消化15 min、低速离心去除单细胞、差速贴壁除去成纤维细胞，在20％ FBS包被的细胞培养瓶中可获得满意的输卵管上皮细胞分离效果，细胞贴壁性良好。培养的细胞在24 h时成团贴壁，48～60 h明显增殖，呈圆形或多角形“铺路石样”的单层细胞生长，72 h后细胞增殖速度减慢，可以维持至10 d以上，且2次传代后细胞贴壁生长良好。经姬姆萨染色和透射电镜观察鉴定为鸡输卵管上皮细胞。本研究建立的鸡原代输卵管上皮细胞分离培养方法可获得纯度较高的目的细胞。
　　为研究鸭源鸡杆菌对鸡原代输卵管上皮细胞的作用，分别以细菌黏附、侵袭试验及借助姬姆萨染色及扫描电镜观察2株不同来源的鸭源鸡杆菌对输卵管上皮细胞的黏附和侵袭特性。黏附计数表明鸭源鸡杆菌Yu-PDS-RZ-1-SLG能高水平黏附输卵管上皮细胞，而菌株F149T对输卵管上皮细胞有较低的黏附。庆大霉素保护试验结果显示2株菌对输卵管上皮细胞均无可见侵袭力。姬姆萨染色及扫描电镜试验进一步证明输卵管上皮细胞表面有细菌黏附，而内部未见有侵袭的细菌，但是Yu-PDS-RZ-1-SLG株接种细胞90 min后，细胞逐渐破碎脱落，而菌株F149T则未见明显细胞损伤。菌株经胰蛋白酶处理后，细菌的黏附率显著降低，表明细菌的表面蛋白参与黏附。ELISA法检测鸭源鸡杆菌感染输卵管上皮细胞后炎性细胞因子的变化，结果表明感染组的IL-6、TNF-α、IFN-γ的含量均高于对照组，且Yu-PDS-RZ-1-SLG感染的细胞所分泌的各细胞因子均高于F149T，提示炎性细胞因子的分泌可能改变局部的微环境，促进细菌在输卵管细胞表面增殖，是造成输卵管上皮细胞损伤的机制之一。
　　为探索鸭源鸡杆菌对输卵管上皮细胞的损伤机制，分别用体外表达的溶细胞毒性的重组蛋白GtxA及其N端与C端结构域作用于输卵管上皮细胞，通过CCK-8及细胞因子检测试剂盒测定细胞的受损程度和细胞因子的变化。结果表明重组蛋白GtxA不但能够抑制输卵管细胞的增殖，而且表现出明显的细胞毒性作用，N端结构域作为独立的元件不能表现毒性作用，但是能够促进毒素蛋白GtxA发挥毒性作用;且输卵管上皮细胞在受到鸭源鸡杆菌重组蛋白GtxA刺激后炎性细胞因子IL-6，TNF-α和IFN-γ表达上调。由此推测，可能是细菌黏附在细胞表面后，增殖过程中分泌的外毒素导致细胞通透性改变，诱导炎症调节因子的表达，并最终造成细胞损伤。

目录

声明

致谢

英文缩写表

摘要

文献综述

1 鸡杆菌概述

1．1 鸡杆菌分类地位的确立

1．2 病原特征

1．3 流行病学

1．4 传播途径

2 鸡杆菌的致病性

3 鸡杆菌毒力因子

3．1 黏附素

3．2 溶血素

3．3 外膜蛋白

3．4 外膜囊泡通道

3．5 金属蛋白酶

3．6 荚膜多糖

4 小结

试验一 鸭源鸡杆菌生物被膜形成能力的测定

引言

1 材料与方法

1．1 菌株

1．2 试剂和器材

1．3 鸭源鸡杆菌的复苏

1．4 生物被膜形成能力定性测定

1．5 生物被膜定量检测

1．6 不同鸭源鸡杆菌分离株生物被膜形成能力的测定

1．7 鸭源鸡杆菌被膜形成的影响因素

1．8 扫描电镜

2 结果与分析

2．1 鸭源鸡杆菌生物被膜形成能力的检测

2．2 定性检测不同培养时间对BF的影响

2．3 定量检测不同培养时间对BF的影响

2．4 定量检测不同营养成分对BF的影响

2．5 生物被膜的扫描电镜

3 结论与讨论

试验二 鸡原代输卵管上皮细胞体外分离培养与鉴定

引言

1 材料与方法

1．1 试验动物

1．2 主要试剂

1．3 鸡原代输卯管上皮细胞的制备与培养条件优化

1．4 鸡原代输卯管上皮细胞的培养条件优化

1．5 形态学观察

1．6 姬姆萨染色观察

1．7 电镜观察

1．8 鸡输卵管上皮原代细胞传代

2 结果与分析

2．1 鸡原代输卯管上皮细胞分离与培养条件优化

2．2 鸡输卯管上皮原代细胞生长状态和形态变化

2．3 姬姆萨染色结果

2．4 鸡输卵管上皮原代细胞透射电镜观察

2．5 鸡输卯管上皮原代细胞传代结果观察

3 结论与讨论

试验三 鸭源鸡杆菌对鸡原代输卵管上皮细胞的作用

引言

1 材料与方法

1．1 菌株

1．2 主要试剂

1．3 细菌的培养

1．4 鸡原代输卵管上皮细胞的制备与培养

1．5 鸭源鸡杆菌对原代输卵管上皮细胞的黏附和侵袭试验

1．6 用胰蛋白酶处理菌体后对细胞黏附力的影响

1．7 姬姆萨染色观察细菌黏附情况

1．8 透射电镜观察细菌侵袭细胞情况

1．9 鸭源鸡杆菌感染原代输卵管上皮细胞后对上皮细胞产生细胞因子的测定

1．10 统计分析

2 结果与分析

2．1 鸭源鸡杆菌对原代输卵管上皮细胞活力的影响

2．2 鸭源鸡杆菌感染量的确定

2．3 鸭源鸡杆菌对输卵管上皮细胞的黏附

2．4 用胰蛋白酶处理鸭源鸡杆菌后对输卵管上皮细胞的黏附

2．5 鸭源鸡杆菌对输卵管上皮细胞的侵袭

2．6 姬姆萨染色观察鸭源鸡杆菌对输卵管上皮细胞的黏附

2．7 透射电镜观察鸭源鸡杆菌对输卵管上皮细胞的侵袭结果

2．8 鸭源鸡杆菌感染输卵管上皮细胞后对细胞因子的影响

3 结论与讨论

试验四 鸭源鸡杆菌毒素蛋白对原代输卯管上皮细胞的作用

引言

1 材料与方法

1．1 菌株

1．2 主要试剂

1．3 主要仪器设备

1．4 重组质粒

1．5 重组GtxA毒素蛋白原核表达及蛋白活性鉴定

1．6 蛋白纯化

1．7 鸭源鸡杆菌GtxA毒素蛋白各区域蛋白对原代输卯管上皮细胞毒性试验

1．8 鸡原代输卵管细胞在GtxA蛋白作用后分泌细胞因子测定

1．9 数据分析

2 结果与分析

2．1 GtxA毒素蛋白的体外表达

2．2 GtxA不同结构域对输卯管上皮细胞的毒性试验

2．3 GtxA不同结构域作用输卵管细胞后对细胞因子的影响

3 结论与讨论

全文总结

参考文献

研究生期间已发表的论文