2014-2015年河南省PEDV遗传变异分析及ISG15与PEDV相互作用的初步探究

摘要

猪流行性腹泻（Porcine epidemic diarrhea,PED）可以引起猪消化道的损伤，进而导致呕吐、水样腹泻和脱水等临床症状，其病原是猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea vrius,PEDV），不同年龄阶段猪群均易感，哺乳仔猪最易感，死亡率最高，该病于1971年英国最先报道，我国在1976年首次报道，2010年来，猪流行性腹泻病再次暴发，哺乳仔猪的感染率和死亡率达到了空前高度，给世界养殖业造成了重大经济损失，鉴于该病的严重性，对该病病原的研究有重要的意义。
　　干扰素刺激基因15（interferon-stimulated gene15,ISG15）编码的ISG15蛋白是最早发现的类泛素修饰蛋白，被Ⅰ型干扰素诱导表达，属于类泛素修饰蛋白家族，ISG15的高水平表达可以影响病毒的复制，而PEDV的先天免疫与ISG15的关系尚不明确。本研究以干扰素缺陷型猴肾细胞系（Vero）为模型，对ISG15在PEDV复制过程中的作用进行了初步的探讨。
　　基于以上背景，本研究对河南省流行性腹泻病毒流行株变异情况进行监测和探究，同时构建稳定表达ISG15蛋白的细胞系，在此基础上探究了PEDV与ISG15蛋白的相互作用，为进一步研究ISG15抗病毒机制和PEDV逃逸细胞先天免疫机制奠定了基础。研究的主要内容分为以下三个部分：
　　1.河南省2014-2015年猪流行性腹泻病毒流行株遗传进化分析
　　对15株2014-2015年间河南省PEDV流行株S基因进行克隆及序列测定，与河南省2011-2013年间流行株以及国内、外代表毒株进行同源性及遗传变异分析，并对这些毒株S基因的N-糖基化位点及跨膜螺旋区域进行预测。结果表明:本试验得到的15株毒株之间S基因核苷酸同源性为97.0-99.8％，氨基酸同源性为97.0-99.5%；与2011-2013年河南流行株核苷酸同源性为97.1-99.0%，氨基酸同源性为97.2-98.8%，与其他地区流行毒株核苷酸同源性为92.2%-99.0%，氨基酸同源性为91.9%-99.0%；与经典毒株相比，S1区域N端存在15bp的插入和6bp的缺失，核苷酸同源性为91.7%-93.6%，氨基酸同源性为92.0%-93.6%。系统发育建树结果显示目前的流行毒株与经典毒株处于不同的两个群，流行毒株分处不同亚群。对N-糖基化位点及跨膜螺旋区域的预测得知2014-2015年河南省PEDV与经典株相比出现变异，与2010年暴发时相比存在部分突变，毒株之间存在部分差异。
　　2.稳定过表达猪ISG15基因Vero细胞系的建立
　　构建稳定表达猪ISG15基因的Vero细胞系，利用真核转座子系统（PiggyBac,PB）将猪源ISG15基因转染入Vero细胞中，通过嘌呤霉素抗性和绿色荧光进行双重筛选获得阳性转染细胞，再经过克隆纯化得到单个阳性细胞株，将细胞进行传代后检测，借助实时定量荧光基因扩增（Real-time Quantitative PCR,qPCR）及蛋白质免疫印迹（western-bloting,WB）方法鉴定该基因的表达，结果表明，筛选得到的piggybc-ISG15-Vero细胞株可稳定表达ISG15，表明稳定表达猪ISG15基因的Vero细胞系构建成功，为进一步研究猪ISG15基因的功能以及作用机制奠定了基础。
　　3.ISG15和PEDV相互作用的初步研究
　　探究ISG15蛋白和PEDV相互作用关系，为后续研究PEDV逃逸细胞先天免疫机制奠定基础，将PEDV疫苗株CV777分别接种于piggybc-ISG15-Vero细胞系及对照细胞系，收集不同时间点的病毒液测定PEDV的拷贝数和滴度，通过统计PEDV在不同细胞系中的增殖滴度，发现ISG15蛋白对PEDV的复制有一定的促进作用，利用qPCR检测PEDV感染piggybac-ISG15-Vero细胞后细胞内ISG15蛋白的表达情况，结果表明PEDV的增殖可以明显刺激细胞内ISG15的表达。具体作用机制还有待进一步研究。

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文献综述

1猪流行性腹泻病毒研究进展

2.干扰素刺激因子ISG15研究进展

试验一 河南省2014-2015年猪流行性腹泻病毒流行株遗传进化分析

1材料与方法

2结果与分析

3.讨论

试验二 稳定过表达猪ISG15基因Vero细胞系的建立

1 材料与方法

2方法

3.结果

4讨论

试验三 3. ISG15和PEDV相互作用的初步研究

1材料

2方法

3结果

4讨论

全文总结

参考文献

英文摘要

附：作者读研期间发表文章