突变型FoxO1转基因小鼠的基因表达及表型分析

摘要

瘦素是来源于脂肪组织的调节动物能量代谢的重要因子，其在中枢的作用主要是抑制动物的食欲并促进动物的能量消耗。瘦素作用于下丘脑上的受体，激活OB-Rb信号通路，发挥其生理调节作用。在瘦素抵抗的情况下，瘦素信号通路受阻，动物表现为肥胖等代谢障碍。有研究显示，动物下丘脑中FoxO1（Forkhead box O1）的增多是导致瘦素抵抗的原因之一。实验室对不同的FoxO1突变体的功能进行了前期研究。其中，敲除了DNA结合结构域(DNA Binding Domain，DBD)的FoxO1，在细胞水平的实验中有促进瘦素信号通路的效应。为了验证其在动物体内的作用，实验室构建成质粒pEF1α-Myc-FoxO1△DBD，利用显微注射法，以C57BL/6为背景，构建了突变型FoxO1转基因小鼠，总共获得了10个转基因首建鼠(Founder)。本论文的目的主要是检测转基因小鼠中目的基因表达的组织分布及其对动物生理的影响。首先，对转基因小鼠进行了基因型鉴定工作，将10个转基因首建鼠与野生型C57BL/6杂交各自扩增成系。作者为建立可靠的基因型鉴定方法，通过更换PCR体系等多方尝试克服了目的基因GC含量高不易扩增的问题，同时在采集鼠尾样本的过程中不断更换手套和清洗灼烧剪刀，并且使用含有滤芯的无菌枪头在超净台中进行加样克服了基因型鉴定易污染的问题，避免了假阳性结果的出现。根据此法，作者已将转基因小鼠鉴定到F5代，其中第8、9两只首建鼠无法繁殖后代，第1、2、3、4、5、6、10系的转基因小鼠根据后续的实验结果只做少量保种，第7系转基因小鼠作为实验对象目前保留500只左右;第二，利用荧光定量PCR的方法检测目的基因在转基因小鼠各组织中的表达水平。结果显示，肝脏中只有第7系小鼠目的基因有高水平表达;大脑中只有第3、7系小鼠目的基因有高水平的表达;白色脂肪组织中只有第7系小鼠目的基因有高水平表达，第3系小鼠目的基因有较低水平表达。下丘脑中第7系小鼠目的基因有高水平表达，第2、3系小鼠目的基因有中等水平表达，第1、10系小鼠目的基因有较低水平表达;棕色脂肪组织和腓肠肌中第7系小鼠目的基因同样有高水平表达;第三，利用Western Blotting检测目的蛋白在第7系转基因小鼠下丘脑中的表达。结果显示，目的蛋白有表达但是水平较低;第四，第7系小鼠的体重与采食量的检测。结果显示，阳性小鼠体重略低于阴性小鼠但差异并不显著，阳性小鼠与阴性小鼠采食量上没有显著差异，但是采食量比体重的比值，呈现显著差异且阳性鼠大于阴性鼠;第五，利用荧光定量定量PCR和Western Blotting检测第7系小鼠瘦素信号通路下游抑制食欲的POMC(Proopiomelanocortin)神经肽和促进食欲的AGRP(Agouti gene-related protein)神经肽的mRNA表达和瘦素敏感性。结果显示，常规条件下POMC和AGRP的表达差异不显著，饥饿小鼠一段时间对小鼠颈静脉注射瘦素并作用一段时间后，检测到阳性小鼠STAT3(Signal transducer and activator of transcription3)磷酸化水平高于阴性小鼠，而POMC的表达实验组相对于对照组没有显著升高;第六，利用荧光定量PCR检测第7系小鼠棕色脂肪中UCP1、2、3(Uncoupling protein1、2、3)的表达。结果显示，UCP1在阳性小鼠的表达明显升高(P＜0.01)，UCP2、UCP3则无显著变化。

目录

声明

致谢

摘要

1 文献综述

1．1 能量代谢障碍综合症

1．2 瘦素

1．2．1 瘦素的发现及分泌

1．2．2 瘦素对能量代谢的影响

1．2．3 瘦素信号通路

1．2．4 瘦素抵抗

1．3 转基因动物

1．4．2 FoxO1的功能

2 引言

3 材料与方法

3．1 材料

3．1．1 试验动物

3．1．2 实验仪器

3．1．3 实验试剂

3．1．4 实验耗材

3．1．5 实验试剂配制

3．2 方法

3．2．1 转染用质粒的获取

3．2．2 pEF1α-Myc-FoxO1ΔDBD、pFoxO1阳性对照蛋白获取

3．2．3 转基因小鼠基因型鉴定

3．2．4 转基因小鼠组织mRNA转录检测

3．2．5 转基因小鼠组织蛋白表达检测

3．2．6 转基因小鼠体重与采食量分析

3．2．7 常规条件下转基因小鼠POMC、AGRP转录水平检测

3．2．8 常规条件下小鼠与饥饿条件下POMC转录水平的对比

3．2．9 转基因小鼠leptin刺激实验

4．2 F1代转基因小鼠基因型鉴定

4．3 F1代转基因小鼠目的基因FoxO1ΔDBD转录水平检测

4．3．1 RNA质量检测

4．3．2 荧光定量PCR检测FoxO1ΔDBD在各品系及不同组织中的表达

4．4 转基因小鼠FoxO1ΔDBD目的蛋白的检测

4．5 转基因小鼠部分表型分析

4．5．1 Line7转基因小鼠体重(Body weight)与采食量(Food intake)检测

4．5．2 常规条件下转基因小鼠POMC、AGRP转录水平检测

4．5．3 常规条件下小鼠与饥饿条件下POMC转录水平的对比

4．5．5 常规条件下转基因小鼠UCP1、UCP2、UCP3转录水平检测

5 讨论与结论

5．1 讨论

5．2 结论

参考文献