野生型人TDP-43转基因小鼠和野生型人TDP-43/突变型人SYN双转基因小鼠的建立及表型分析

摘要

研究背景：额颞叶变性(FTLD,Frontotemporal lobar degeneration)是一种发生于老年前期的痴呆综合征,主要表现为人格改变、社会行为异常及语言功能障碍。肌萎缩侧索硬化(ALS,Amyotrophic lateralsclerosis)是一种以脑和脊髓的运动神经元进行性变性为特征的神经肌肉疾病。FTLD和ALS的病理学特征都表现为受损区域的神经元胞浆和胞核内有泛素化的包涵体,这种包涵体的主要组成成份是反式激活-反应性DNA结合蛋白-43(TDP-43,TAR DNA binding protein-43)。TDP-43是一种广泛表达的核蛋白,由1号染色体上的TARDBP基因(TARDBP)编码。研究发现,在少数的家族性和散发性ALS、ALS合并FTLD的患者中存在TARDBP突变,而大部分存在TDP-43病理的ALS、FTLD-TDP患者中却并无TARDBP突变,并且有Z4RDBP突变和无TARDBP突变的ALS患者之间比较,两者的TDP-43病理并无区别,这说明野生型人TDP-43(WT hTDP-43,wild-type humanTDP-43)也可能导致神经毒性,并且可能在这些神经变性疾病的发病机制中起一定的作用。然而,TDP-43的生理功能及致病机制迄今为止尚未完全明确。
　　作为散发性ALS和FTLD的病理学标志,TDP-43蛋白也见于其他的神经变性疾病,如帕金森病(PD,Parkinson’s disease)及其他的相关疾病中。PD是以中脑黑质多巴胺神经元进行性丢失为特征的神经退行性疾病。人α-突触核蛋白(hSYN,human alpha-synuclein)基因是PD的致病基因,含突变型人SYN(MUT hSYN,mutanthSYN)基因的过度表达可以导致MUT hSYN转基因小鼠中脑黑质多巴胺神经元的死亡。由于在PD及其相关疾病患者的组织中也发现有TDP-43包涵体的存在,而且目前认为,神经变性疾病的发病机制有多种因素的参与,因此我们推测TDP-43也可能在多巴胺神经元丢失的机制中起一定的作用。
　　目的：1.明确在遗传上可控的动物模型中,WT hTDP-43的表达是否可以导致神经毒性。2.验证我们的假说:TDP-43是否可以增加SYN对多巴胺神经元的毒性。
　　方法：第一部分构建WT hTDP-43转基因小鼠模型,通过TDP-43基因PCR扩增以及免疫印迹对其进行鉴定,通过常规观察监测其疾病表型,通过旋转试验进行行为学测定。若400天之后仍未见WThTDP-43小鼠有明显的疾病表现型,则取其脑、脊髓和骨骼肌,进行ALS及FTLD相关的神经病理学分析。同龄的非转基因小鼠(NT,nontransgenic mice)作为对照组做同样处理。神经病理学分析方法包括免疫组织化学染色、组织化学染色、双标记免疫荧光染色、甲苯胺蓝染色、焦油紫染色以及前额叶皮质和海马齿状回神经元的立体计数。第二部分双突变的MUT hSYN转基因小鼠由Dr.Richfield赠送。我们将WT hTDP-43小鼠和双突变的MUT hSYN小鼠进行交配,并通过PCR分析进行基因分型,获得WT hTDP-43/MUT hSYN双转基因小鼠。通过对这些小鼠进行常规观察和行为学测定,分析疾病表型。若观察至200天之后WT hTDP-43/NUT hSYN小鼠仍未见明显的疾病表型,则对其进行中脑的神经病理学分析。同龄的NT作为对照组做同样处理。分析方法包括免疫组织化学染色、双标记免疫荧光染色和中脑黑质致密部的多巴胺神经元立体计数。
　　结果：第一部分(1)PCR和Western bolt的结果显示,在WThTDP-43转基因小鼠中有WT hTDP-43的表达,而在NT中未见相应表达。(2)在WT hTDP-43小鼠的大脑、脊髓及骨骼肌中均可见hTDP-43的大量表达,并且其主要位于核内,而NT的相应组织中未见表达。在WT hTDP-43小鼠脊髓前角细胞的胞浆内偶可见hTDP-43分布,但未见明显的hTDP-43阳性包涵体。(3)对WT hTDP-43小鼠的常规观察及行为学测定未发现明显的疾病表现型。(4)同NT相比,WT hTDP-43小鼠的神经病理学分析未表现出ALS的病理特征,即使在晚期阶段也未检测到运动系统的病理损害、泛素化的包涵体聚集或胶质细胞的活化。(5)同NT相比,在WT hTDP-43小鼠中,WThTDP-43的过度表达导致了前额叶皮质神经元的丢失,而海马齿状回的神经元丢失不明显。第二部分(1)在WT hTDP-43/MUT hSYN双转基因小鼠模型中,可见hTDP-413和hSYN在多巴胺神经元的表达,而在NT中未见相应表达。(2)同MUT hSYN小鼠相比,WThTDP-43/MUT hSYN小鼠中WT hTDP-43和MUT hSYN的共同表达导致了更严重的多巴胺神经元的丢失。
　　结论：(1)WT hTDP-43的过量表达可以导致小鼠前额叶皮质神经元的丢失,并且其毒性的产生不依赖于胞浆内TDP-43的聚集或ubiquitin包涵体的形成。(2)WT hTDP-43可以增加MUT hSYN对多巴胺神经元的毒性。TDP-43和SYN在神经变性疾病的发病机制中可能起协同作用。