麦根腐平脐蠕孢假定分泌蛋白CsSP3及CsSP4基因的功能研究

摘要

小麦根腐病是由多种病原菌引起的世界性土传病害，不同地区病原菌差异较大，麦根腐平脐蠕孢是黄淮麦区小麦根腐病的病原菌。目前对麦根腐平脐蠕孢的形态、分类等方面已进行广泛研究，但对其致病分子机理研究很匮乏。本论文通过遗传学方法分析分泌蛋白CsSp3和CsSp4在病原菌致病中的作用，为麦根腐平脐蠕孢的致病机理奠定基础，为麦根腐平脐蠕孢的有效防控提供一定的依据。
　　分泌蛋白在病原菌与植物互作系统中扮演着十分重要的角色，通过对植物病原分泌蛋白功能及其作用机制的研究极大地促进了对植物致病性的了解。通过对麦根腐平脐蠕孢与小麦互作的转录组分析，鉴定到4个具有相同表达模式且在侵染阶段诱导表达的基因。分析其蛋白结构发现均具有分泌蛋白典型的特点，包括N端典型的信号肽结构及多个糖基化和丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸磷酸化位点，由此初步判定为分泌蛋白，并分别命名为CsSP1(Cochliobolus sativus Secreted Protein gene1)、CsSP2、CsSP3、CsSP4。前期获得CsSP1基因缺失突变体菌株，其致病性丧失，由此推测其他的分泌蛋白可能也具有类似的功能。本研究分析了CsSP3和CsSP4在麦根腐平脐蠕孢侵染过程中的功能，主要结果如下:采用反向遗传学的研究思路，利用split-marker方法构建含有HYG（潮霉素磷酸转移酶基因）基因的敲除盒，通过PEG介导的原生质体转化和体内同源重组得到抗潮霉素的转化子。利用PCR初步筛选，经Southem验证，获得CsSP3基因的缺失突变体。CsSP3基因及上游1.6kb启动子区域共同构建到3'端含有GFP序列的pKNTG载体上，转入Δcssp3突变体中，获得基因互补的转化子。生物学性状测定结果显示，与野生型和互补菌株相比，Δcssp3在菌落形态、菌落生长速度和产孢量方面没有明显差别。而利用分生孢子接种小麦和大麦叶片及小麦胚芽鞘，结果显示Δcssp3虽然能侵染发病，但在叶片和胚芽鞘上形成的病斑明显减小，说明Δcssp3参与麦根腐平脐蠕孢的致病性;盆栽接种实验结果显示，Δcssp3突变体和CK对照的小麦的地上和地下部分的生长量没有明显差别，但野生型菌株明显抑制小麦根部伸长，显示Δcssp3突变体抑制小麦营养生长的能力下降，表明CsSP3基因与麦根腐平脐蠕孢对小麦叶片和茎基部的致病性有关，可能参与侵染小麦根部的次生代谢过程，进而抑制寄主小麦根的伸长。
　　为了明确CsSP3编码产物的亚细胞定位，构建了RP27强启动子驱动的CsSP3-GFP过量表达载体，转化野生型菌株，通过对其分生孢子、芽管、营养菌丝和洋葱表皮模拟侵染的附着胞和侵染菌丝的荧光检测发现，CsSp3-GFP融合蛋白定位于液泡内，通过尼罗红染色证实CsSp3-GFP融合蛋白与液泡中的脂滴共定位，在幼嫩分生孢子、芽管和附着胞中多在聚集融合的大脂滴上，侵染菌丝的脂滴小且较分散，推测CsSP3可能与脂肪代谢和甘油运输至附着胞维持侵染膨压有关。综合上述结果，推定的具有编码信号肽分泌蛋白的CsSP3基因与麦根腐平脐蠕孢对寄主叶片的致病性有关，并参与某种次生代谢过程来抑制小麦根部生长，编码产物定位于液泡并与脂滴共定位，可能与脂肪氧化和产物转运有关，为麦根腐平脐蠕孢的生长提供能量，并维持附着胞高膨压，有利于突破寄主小麦的第一道防御屏障，建立寄生关系。
　　同样的策略，成功获得CsSP4基因的敲除突变体，但突变体在菌落形态、生长速度、产孢量及致病性方面与野生型没有明显差别。

目录

声明

致谢

摘要

1 文献综述

1．1 麦根腐平脐蠕孢研究概述

1．1．1 小麦根腐病的发生

1．1．2 麦根腐平脐蠕孢的形态特征

1．1．3 麦根腐平脐蠕孢的生活史

1．1．4 麦根腐平脐蠕孢造成的为害

1．1．5 麦根腐平脐蠕孢致病的分子机制研究

1．1．6 防治方法

1．2 分泌蛋白的研究概述

1．2．1 分泌蛋白

1．2．2 病原菌中分泌蛋白的研究进展

1．3 本研究的目的和意义

2 引言

3 材料与方法

3．1 CsSP3／CsSP4基因敲除盒构建的材料与方法

3．1．1 材料、试剂和仪器

3．1．2 试验方法

3．2 CsSP3／CsSP4基因敲除原生质体转化的材料与方法

3．2．1 材料、试剂和仪器

3．2．2 试验方法

3．3 CsSP3／CsSP4转化子验证的材料与方法

3．3．1 材料、试剂和仪器

3．3．2 试验方法

3．4 CsSP3／CsSP4突变体生长性状和致病性检测

3．4．2 试验方法

3．5．2 试验方法

3．6 CsSP3基因编码蛋白的表达和亚细胞定位

3．6．1 材料、试剂和仪器

3．6．2 试验方法

4 结果与分析

4．1 CsSP3／CsSP4基因敲除盒构建

4．1．1 CsSP3／CsSP4基因及蛋白序列分析

4．1．2 CsSP3／CsSP4基因敲除盒的构建

4．2 △cssp3／△cssp4转化子验证

4．2．1 四对引物的PCR检测

4．2．2 Southern blot验证

4．3．1 △cssp3／△cssp4缺失突变体表型变化

4．3．2 △cssp3缺失突变体对H2O2耐受性无变化

4．3．4 △cssp3缺失突变体对小麦的致病力减弱／△cssp4转化子对小麦致病力无影响

4．4 CsSP3基因功能回复验证

4．4．2 △cssp3互补转化子的获得

4．5．2 △cssp3定位转化子的获得以及CsSp3-GFP融合蛋白表达

4．5．4 CsSP3基因亚细胞pKNTG-定位载体的构建

4．5．6 pKNTG-CsSp3-GFP融合蛋白表达及亚细胞定位

5 结论与讨论

5．1 结论

5．2 讨论

参考文献