熟制馒头贮藏过程中微生物群落结构分析以及脉冲强光杀菌技术研究

摘要

馒头是我国人民的传统主食，随着人们消费水平的提高和生活节奏的加快，馒头在我国主食产业中占据着越来越大的比重。然而，由于馒头营养丰富且含水量较高的特点，在生产和流通过程中极易受到多种有害微生物的污染，为食品安全带来严重隐患。
　　以馒头的表皮、中心和上部为研究对象，比较保藏过程中色差、水分含量以及组织结构等各品质指标的变化规律。在同一年当中的冬季（12月）和夏季（6月）采用同样的工艺和制作条件制作馒头后，分别提取馒头各个部位中微生物菌群基因组DNA，采用16S和18S区间通用引物扩展，构建DNA文库，对该文库进行高通量测序分析，以了解馒头中的微生物多样性。通过聚类分析，得到了不同微生物种类在馒头贮藏过程中的变化趋势及馒头表面外源性污染微生物分布规律。以上述规律为依据选取金黄色葡萄球菌为外源性污染指示菌，探究脉冲强光杀菌技术在馒头表面杀菌中的应用效果。利用luxS调控基因缺失突变体菌株，结合多种胁迫处理，探究压力胁迫对脉冲强光杀菌效果的影响以及脉冲强光处理后与之相关的基因调控现象。课题主要研究结果如下:
　　1、在蒸煮熟制过程中，馒头表面和中心的温度变化趋势结果表明在馒头表皮温度达到100℃后，中心温度上升缓慢滞后12min，并且在熟制过程中其中心温度保持时间不长，只有表面保持时间的20％。在保藏过程中，馒头表面、中心和内部在pH、外观、物理结构和水分含量上均表现出差异。由此作为馒头各部位菌落结构差别的依据进行下阶段实验。
　　2、通过微生物多样性分析，共得到细菌48种，主要的细菌种类为:芽孢杆菌属Bacillus，葡萄球菌属Staphylococcus，虚构芽胞杆菌属Fictibacillus，蓝藻纲Cyanobacteria，不动杆菌属Acinetobacter等。其中芽孢杆菌属占据的比例最大，是馒头中的优势菌种，并且在馒头各个部位均有分布，是一种内源性微生物，在馒头发酵过程中芽孢杆菌属的乳酸菌是主要的发酵微生物之一。除芽孢杆菌属外，葡萄球菌属是占比最大的细菌，主要分布在馒头表面并且分布规律明显受到季节影响。由此可以推断葡萄球菌属是馒头夏季外源污染的主要细菌。酵母目是18S rDNA组别中占比量最大的微生物，高达50％以上。此外得到真菌75种，主要种类包括:酵母目Saccharomycetales，腔菌目Pleosporales，煤炱目Capnodiales，座囊菌纲Dothideomycetes，米根霉Rhizopus-oryzae，散囊菌目Eurotiales，上述物种构成了保藏过程中的优势菌种。米根霉和腔菌目的两种真菌，是造成馒头色泽变化的主要原因。其中腔菌目和酵母菌目在馒头中心和内部的菌落丰度有明显的差别。真菌在各个部位中未表现出明显的外源性污染倾向，均来自于馒头制作原料和水源。
　　3、由微生物群落分析得到馒头表面外源性污染微生物是葡萄球菌属细菌，故以食品中分布较为广泛的金黄色葡萄球菌为葡萄球菌属代表，选取单脉冲能量和闪照距离作为控制条件探究脉冲强光对馒头表面外源性污染微生物的杀菌作用，结果表明，脉冲强光在单脉冲能量500J，闪照距离9cm，闪照20次后能够使馒头表面金黄色葡萄球菌的菌落数减少了1.7log CFU/g。在保藏五天后，相比对照组，使用脉冲强光处理后的样品组其菌落数明显滞后，说明脉冲强光对馒头表面的微生物能够产生很好的抑制作用。
　　4、由于luxS基因参与的基因调节机制广泛影响细菌的修复和增殖过程，为探究该基因以及压力胁迫对脉冲强光杀菌的影响，将金黄色葡萄球菌和缺失了luxS基因的突变体金黄色葡萄球菌株在pH4.5、pH9.5，温度为4℃，45℃的环境下处理4h，24h后，再利用脉冲强光处理上述压力适应性菌株。结果显示，胁迫适应性处理均没有减弱脉冲强光对金黄色葡萄球菌的抑制作用。且缺失了luxS基因的金黄色葡萄球菌经碱处理后，对脉冲强光杀菌更加敏感，表明采用脉冲强光处理碱性胁迫适应下的金黄色葡萄球菌的杀菌效果与luxS基因参与的基因调节有关。

目录

声明

致谢

论文说明

摘要

第一章 绪论

1．1．1 馒头商品属性的主要影响因素

1．1．2 馒头的保藏技术

1．2 脉冲强光技术

1．2．1 脉冲强光技术的原理

1．2．2 脉冲强光的应用

1．3 微生物群落分析

1．3．1 微生物群落分析在食品领域的应用

1．3．2 高通量测序在微生物群落分析中的优点

1．4 本论文的研究意义和内容

1．4．1 研究意义

1．4．2 研究的主要内容

第二章 馒头结构中微生物群落分析

2．2．3 馒头的制备

2．2．4 馒头取样

2．2．5 馒头品质指标的测定

2．2．6 馒头中微生物多样性分析

2．2．7 数据处理

2．3 结果与分析

2．3．1 馒头不同部位的品质变化

2．3．2 保藏过程中馒头色泽的变化

2．3．3 16S rDNA／18S rDNA基因测序的特征

2．3．4 馒头各部分之间的菌群差异分析

2．3．5 馒头在保藏过程中菌落结构的变化

2．3．6 微生物丰度比例

2．3．7 微生物群落与季节和馒头结构之间的关系

2．4 本章小结

第三章 脉冲强光对馒头表面微生物的杀灭作用

3．2．1 材料和仪器

3．2．2 样品的制备

3．2．3 馒头制作及人工污染

3．2．4 脉冲强光处理

3．2．5 微生物计数

3．3 结果与分析

3．3．1 脉冲强光对金黄色葡萄球菌悬液的杀菌效果

3．3．2 脉冲强光对馒头表面金黄色葡萄球菌的杀菌效果

3．4 小结

第四章 脉冲强光对胁迫适应性下食源性致病菌的抑制作用

4．1 前言

4．2 材料与方法

4．2．1 主要的材料与试剂

4．2．2 主要的仪器与设备

4．2．3 细菌悬液的制备

4．2．4 细菌胁迫处理

4．2．5 脉冲强光处理

4．2．6 细菌计数

4．2．7 数据处理

4．3 结果与分析

4．3．1 胁迫处理对金黄色葡萄球菌数量的影响

4．3．2 24h长时间胁迫处理对脉冲强光处理的影响

4．3．3 4h短时间胁迫处理对脉冲强光处理的影响

4．3 小结

第五章 结论和创新点

5．2 创新点和展望

5．2．1 创新点

5．2．2 工作展望

参考文献

附表