家蝇cecropiN-A2和lectin subunit alpha蛋白对金黄色萄球菌的抑制及其抗炎活性研究

摘要

抗菌肽具有广谱的杀菌活性、对哺乳动物没有毒性、自身不易引发耐药性等特性，使其成为研发一种新型抗生素最好的资源之一。Cecropin是一种抗菌肽。Lectin能起到抗菌和消炎的作用，并且和抗菌肽都被定性为免疫因子。家蝇(Musca domesticaL)普遍存在并且携带至少100种人类和动物疾病，然而他们能快速繁殖生长且自身不会引起疾病感染，所以家蝇必定具有完善而高效的免疫防御机制，是人们研究天然抗炎物质的重要资源。试验旨在研究家蝇cecropin-A2(Mdc-A2)和lectin subunit alpha(Lsa)蛋白在金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)刺激下的炎性反应。
　　1)家蝇Mdc-A2蛋白在S.aureus刺激下的炎性反应。
　　扩增Mdc-A2基因，构建在pLEX载体上，通过慢病毒转染的方法，将构建好的载体pLEX-Mdc-A2及pLEX分别转染到RAW264.7细胞中，通过筛选，获得稳定表达的RAW-Mdc-A2及RAW-pLEX细胞系，其中RAW-pLEX细胞作为阴性对照。通过S.aureus刺激细胞后，收集未刺激和刺激后3h，6h，12h和24h的细胞，且收集未刺激和刺激6h细胞的上清液。提取细胞中的RNA，通过实时定量PCR(Real-Time PCR)的方法检测细胞中TNF-α，IL-1β，NFκB-1和NFκB-2的mRNA相对转录水平;通过Lipoteichoic acid(LTA)刺激细胞后，收集未刺激和刺激后6h的细胞及其细胞的上清液，提取RNA，通过Real-Time PCR的方法检测TNF-α、NF-κB-1和NF-κB-2的mRNA相对转录水平;TNF-α蛋白水平的表达通过酶联免疫吸附测定(ELISA)。通过菌落计数计算每毫升细胞的上清液中的细菌数量。
　　Western blotting分析表明，Mdc-A2.在RAW264.7细胞中稳定表达。Real-Time PCR结果表明，在S.aureus刺激后，与RAW-pLEX细胞相比，RAW-Mdc-A2细胞中TNF-α的两个转录剪接体的相对转录水平，TNF-α-tv-1在6h和12h显著下调(P＜0.05)，TNF-α-tv-2在3h，6h和12h显著下调(P＜0.05);RAW-Mdc-A2细胞中L-1β的两个转录剪接体的相对转录水平，IL-1βT在3h，6h和12h显著下调(P＜0.05），IL-1β在3h和6h显著下调（P＜0.0.05)。在S.aureus刺激6h后，RAW-Mdc-A2细胞的上清液中，ELISA检测和菌落计数表明，TNF-α的转录和生产水平及其上清中的细菌数量均显著下调（P＜0.05）。在LTA刺激6h后，TNF-α的转录和生产水平同样显著下调（P＜0.05）。在S.aureus刺激后，与RAW-pLEX细胞相比，RAW-Mdc-A2细胞中NFκB-1基因的相对转录水平在3h，6h和12h显著下调(P＜0.05)，NFκB-2基因的相对转录水平在6h显著下调(P＜0.05)。在LTA刺激6h后，与RAW-pLEX细胞相比，RAW-Mdc-A2细胞中NFκB-1基因的相对转录水平显著下调(P＜0.05)。
　　2)家蝇Lsa蛋白在S.aureus刺激下的炎性反应。
　　通过慢病毒转染的方法，将构建好的载体pLEX-Lsa及pLEX分别转染到RAW264.7细胞中，通过筛选，获得稳定表达的RAW-pLEX-Lsa及RAW-pLEX细胞系，其中RAW-pLEX细胞作为阴性对照。然后通过S.aureus刺激细胞，收集未刺激和刺激后3h，6h，12h和24h的细胞，且收集未刺激和刺激6h细胞的上清液。提取RNA，通过Real-Time PCR检测炎性细胞因子TNF-α,IL-1β，NFκB-1和NFκB-2基因的相对转录水平。通过ELISA试剂盒检测细胞的上清液中TNF-α和IL-1β的蛋白水平。Real-Time PCR结果显示，在S.aureus刺激后，与RAW-pLEX细胞相比，RAW-pLEX-Lsa细胞中TNF-α的两个转录剪接体的相对转录水平，TNF-α-tv-1在6h显著下调（P＜0.05），TNF-α-tv-2在6h和12h显著下调(P＜0.05）;RAW-pLEX-Lsa细胞中IL-1β的两个转录剪接体的相对转录水平，IL-1βT在3h，6h和12h显著下调（P＜0.05），IL-1β在3h和6h显著下调(P＜0.05);RAW-pLEX-Lsa细胞中NFκB-1和NFκB-2基因的相对转录水平无明显下降趋势。ELISA检测结果显示，在S.aureus刺激6h后，与RAW-pLEX细胞相比，RAW-pLEX-Lsa细胞的上清液中，TNF-α的蛋白水平显著下调(P＜0.05）。
　　结论:
　　1)家蝇Mdc-A2蛋白拥有有效地抗菌和抗炎活性。Mdc-A2通过抑制NFκB信号通路的活性进而发挥抗炎活性。
　　2)家蝇Lsa蛋白可以有效地发挥抗炎活性，显著地抑制TNF-α和IL-1β的转录和生产，而TNF-α和IL-1β的转录和生产的下调并不是通过抑制NFκB信号通路的活性引起的。

目录

声明

致谢

摘要

第一章 文献综述

1．1 抗菌肽的定义及概述

1．1．1 抗菌肽数据库

1．2 抗菌肽的来源及分类

1．2．1 生物来源分类

1．2．2 二级结构分类

1．3．2 抗真菌活性

1．3．3 抗病毒活性

1．3．4 抗寄生虫活性

1．3．5 抗肿瘤活性

1．3．6 免疫系统调节

1．4 抗菌肽作用机制

1．4．1 细胞膜损伤机理

1．4．2 细胞内杀菌机制

1．5 抗菌肽的应用

1．5．1 抗菌肽在动物生产中的应用

1．5．2 抗菌肽在医药方面的应用

1．5．3 抗菌肽在食品方面的应用

第二章 引言

第三章 家蝇Mdc-A2抗炎及抗菌活性

3．1 材料与方法

3．1．1 材料

3．1．2 方法

3．1．3 统计分析

3．2 结果与分析

3．2．2 Western blotting的检测结果

3．2．3 细胞RNA提取结果

3．2．4 标准品的制备

3．2．5 S．aureus和LTA刺激前后细胞因子及其细菌数量的检测

3．3 讨论

3．4 小结

第四章 家蝇Lsa在S．aureus刺激下的炎性反应

4．1 材料与方法

4．1．1 材料

4．1．2 方法

4．1．3 统计分析

4．2 结果与分析

4．2．1 获得重组pLEX-Lsa载体

4．2．2 Western blotting的检测结果

4．2．3 细胞RNA提取结果

4．2．4 标准品的制备

4．2．6 S．aureus刺激前后IL-1βT和IL-1β的相对转录水平及IL-1β的产量

4．2．7 S．aureus刺激前后NFκB-1和NFκB-2的相对转录水平

4．3 讨论

4．4 小结

第五章 结论

参考文献