兔原始生殖细胞体外培养条件的优化

摘要

原始生殖细胞(Primordial germ cells，PGCs)在胚胎和个体发育过程中，经不断分裂发育和分化演变为成体动物器官中的精子和卵细胞。体外分离培养兔PGCs是为胚胎早期发育机理、生殖细胞、细胞疫苗生产、永生化细胞等研究提供大量的细胞。但是，兔PGCs的体外培养方法、传代方法以及建系仍存在许多问题，影响了兔PGCs细胞的应用。兔PGCs体外培养的试验，除可解决这些问题外，也可为大家畜、实验动物的相关研究提供参考。所以建立稳定、高效的增殖传代兔PGCs的方法非常重要。本试验以兔16-20d的胚胎为研究对象，比较了其胎龄、饲养层种类、饲养层密度、分离方法、传代方法及细胞因子等因素对PGCs分离培养的影响。改善兔PGCs体外分离培养的条件，提高兔PGCs集落数量和质量。为建立稳定的兔PGCs体外分离培养方法提供参考。试验主要结果如下:
　　1.分离培养鼠、兔胚胎成纤维细胞（mouse embryo fibroblast，MEF、rabbit embryo fibroblast，REF）。选取昆明白近交系小鼠12-15d胎鼠和日本大耳白兔16-18d胎兔为材料，分离MEF、REF，获得生长增殖能力强，纯度高，生物学性状稳定的细胞。将分离得到的MEF、REF按首次换液时间分为6组:分别是12h换液组、24h换液组、36h换液组、48h换液组、60h换液组、72h换液组，原代细胞首次换液后，每2d传代一次，根据细胞密度传代培养至P3代;记录0-3代的细胞密度及培养时间。用细胞计数法绘制P1、P3、P8代MEF、REF的生长曲线;比较MEF、REF各代细胞冻存后复苏率，选取冻存30d、60d、90d的P1、P3、P8代进行复苏，并计算复苏率。结果显示:(1)24h首次换液组P0-P3代细胞培养的总时间与其他换液组比较差异显著(P＜0.05)。(2)P3代的MEF、REF生长增殖速度快，活性好，形态结构稳定，且纯度高，与P1、P8代比更适合作为饲养层细胞用于后续试验。(3)经30d、60d（短时间）冻存的P1、P3代MEF、REF，复苏率较高，复苏后活力好，生物学性状稳定。但由于P1代杂细胞含量较多，复苏后需传2-3代进行纯化，本试验选P3代MEF、REF短时间冻存，用于后续试验。
　　2.饲养层及传代方法对兔PGCs分离培养的影响。本试验选用日本大耳白兔16-20d胚胎生殖嵴分离PGCs。用RT-PCR检测转录因子Oct-4的表达，碱性磷酸酶染色等方法进行鉴定。并且从胎龄、分离、传代方法、饲养层密度及种类上对兔PGCs的培养体系优化。得出以下结论:(1)18-20d兔胚胎生殖嵴形态结构发育完善，能够获得较多的兔PGCs细胞。(2)将分离的兔PGCs，接种到5×104/mL、1×105/mL、5×105/mL密度的MEF、REF饲养层上，兔PGCs在密度为5×105/mL的MEF、REF饲养层上，集落的形成率高且出现时间早，呈典型的桑葚状、鸟巢状聚集生长，保持未分化时间较长，与饲养层细胞之间界限清晰。(3)通过兔PGCs比较在MEF、REF、（MEF、REF按1∶2比例制成的）混合饲养层上的生长行为，证明了同源REF饲养层优于混合饲养层，优于异源饲养层MEF。(4)采用胰酶消化法和机械法分离兔PGCs，胰酶消化法比机械法分离得到的原代兔PGCs集落数量更多，在REF饲养层上成功传至P5代，是更适合兔PGCs分离的方法。(5)对比了胰酶消化法、机械法、连同饲养层一起消化法。结果发现，机械法传代最有利于兔PGCs传代培养和集落的形成，传代后的兔PGCs集落形态佳，为理想的兔PGCs传代方法。RT-PCR检测转录因子Oct-4的表达，碱性磷酸酶染色等方法鉴定的结果呈阳性。
　　3.细胞因子对兔PGCs分离培养的影响。将兔PGCs接种于A、B、C、D四种培养液中，培养液A:基础液+10％FBS+5ng/mL LIF+2ng/mL bFGF+2ng/mL TGF-β1;培养液B:基础液+10％FBS+10ng/mL LIF+4ng/mL LIF+4ng/mL bFGF+2ng/mL TGF-β1;培养液C:基础液+10％FBS+15ng/mL LIF+6ng/mLbFGF+3ng/mL TGF-β1;培养液D:基础液+10％FBS（对照组）。在培养液中添加细胞因子，可以延长兔PGCs体外存活时间。细胞因子、饲养层两者协同作用能够促进兔PGCs的生长增殖，并保存兔PGCs集落的未分化状态。结果显示，与培养液D（对照组无细胞因子）相比，培养液B中添加LIF、bFGF、TGF-β1三种细胞因子对兔PGCs增殖及保持其未分化时间都有积极影响;本研究中，以REF为饲养层，培养液B为培养液时，培养兔PGCs的效果最佳。

目录

声明

论文说明

致谢

摘要

文献综述

1 PGCs的起源、发生

2 PGCs谱系限定

3 PGCs的迁移

4 PGCs的研究进展

4．1 各种动物PGCs的研究现状

5 PGCs的生物学特性

5．1 PGCs的形态和生长特性

5．2 PGCs分化的全能性

6 PGCs的分离培养

6．1 PGCs的分离方法

6．2 PGCs的传代方法

7 PGCs的鉴定

7．1 形态学及生长行为鉴定

7．2 碱性磷酸酶(AKP)染色鉴定

7．3 发育全能性标志基因的表达

8 影响PGCs体外分离培养的因素

8．1 胚胎日龄及获取PGCs的时间

8．2 分离培养方法

8．3 饲养层

8．4 培养基

8．5 添加物

9 PGCs的应用前景

试验一 鼠、兔胚胎成纤维细胞的分离培养

引言

1 材料与方法

1．1 试验材料

1．2 主要溶液配制

1．3 试验方法

2 结果与分析

2．1 MEF、REF生物学特性

2．2 首次换液时间对MEF、REF的影响

2．3 MEF、REF传代培养

2．4 MEF、REF染色结果

2．5 MEF、REF生长曲线的绘制

2．6 MEF、REF冻存不同时间的复苏效果

3 讨论

3．1 鼠、兔胚胎日龄与MEF、REF的关系

3．2 首次换液时间对MEF、REF的影响

3．3 MEF、REF的代数对细胞活力及生长曲线的影响

3．4 影响MEF、REF冻存、复苏的因素

4 小结

试验二 饲养层及传代方法对兔PGCs体外分离培养的影响

引言

1 材料与方法

1．1 试验材料

1．2 主要溶液的配制

1．3 试验方法

2 结果与分析

2．1 不同日龄兔生殖嵴形态

2．2 兔PGCs的形态鉴定

2．3 不同密度饲养层对兔PGCs的影响

2．4 不同饲养层对兔PGCs的影响

2．5 不同分离方法对兔PGCs的影响

2．6 P3代MEF、REF及混合饲养层活力的检测

2．7 不同传代方法对兔PGCs的影响

3 讨论

3．1 不同胎龄对兔PGCs的影响

3．2 不同密度饲养层对兔PGCs的影响

3．3 不同饲养层对兔PGCs的影响

3．4 不同分离方法对兔PGCs的影响

3．5 不同传代方法对兔PGCs的影响

4 小结

创新点

试验三 细胞因子对兔PGCs分离培养的影响

1．1 试验材料

1．2 主要溶液的配制

1．3 试验方法

2 结果与分析

2．1 兔PGCs生长行为的观察

2．2 兔PGCs碱性磷酸酶(AKP)染色

2．3 兔PGCS RT-PCR检测

2．4 不同细胞因子及浓度对兔PGCs的影响

3 讨论

3．1 血清浓度对兔PGCs的影响

3．2 非细胞因子添加物对兔PGCs的影响

3．3 细胞因子及浓度对兔PGCs的影响

4 小结

创新点

参考文献

缩写词中英对照表