COLD-PCR用于混合检材中微量等位基因富集的可行性

摘要

背景：来自两个或两个以上个体的混合检材是法医物证检验中经常遇到的疑难检材类型之一。随着高灵敏检测技术、高多态性和性连锁等特殊遗传标记的普及应用，从混合检材中获取证据信息的能力不断提高。但即使对于经验丰富的专家来说，实际案件中一些混合检材的检测和结果解释仍然是一个巨大的挑战。如何对组份含量差异较大的混合检材中的少量成份进行分型，是当前法医 DNA分析的难题之一。
　　目的：建立人类 Y染色体 M175插入/缺失基因座的 COLD-PCR(co-ampLification atlower denaturation temperature PCR)技术，比较COLD-PCR与常规PCR对不同比例混合样品的扩增分型效果，初步探讨COLD-PCR用于法医混合检材中低水平等位基因富集扩增分型的可行性。
　　方法：首先建立人 Y-M175基因座的常规 PCR-聚丙烯酰胺凝胶电泳（PCR-PAGE）银染法分型技术，调查103名河南汉族男性无关志愿者的基因型。用蛋白酶 K消化-酚/氯仿法提取插入和缺失型个体的基因组 DNA，按不同比例混合制备成混合样品。用梯度保温异源双链消减法测定 M175大扩增子(171/166bp)的临界变性温度（criticaldenaturation temperature，Tc），高分辨率熔解率曲线法（high resolution melting analysis，HRM）测定M175短扩增子(91/86bp)的Tc值。以Tc值为基础，通过在常规PCR的变性和退火之间增加扩增产物杂交和异源双链变性两个步骤，分别建立和优化基于 PAGE-银染法（大扩增子）和实时定量法（小扩增子）的 COLD-PCR技术，比较常规 PCR和 COLD-PCR对不同比例混合样品的扩增分型效果。
　　结果：河南汉族 Y-M175基因座插入和缺失型的频率分别为0.1650、0.8350。M175大扩增子的 Tc值为76.4℃，小扩增子的 Tc值为78.4℃，优化后采用的COLD-PCR异源双链变性温度分别为76.4和78.2℃。大扩增子PAGE-银染法，常规 PCR可以有效分型的混合样品的组分比例为5∶1，而 COLD-PCR至少可以达到20∶1。小扩增子实时定量法，常规 PCR可以有效分型的混合样品的组分比例为16∶1，而COLD-PCR至少可以达到64∶1。
　　结论：使用与常规 PCR相同的设备和试剂， COLD-PCR能实现混合样品中微量等位基因的富集扩增，扩大可分型混合检材的范围，改进分型效果，在混合检材的法医DNA分型中有潜在应用价值。

目录

第1章 绪论

1.1法医混合检材

1.2法医混合检材鉴定研究现状

1.3 COLD-PCR简介

第2章 河南汉族Y染色M175基因座的遗传多态性

2.1背景

2.2材料

2.3方法

2.4结果

第3章 普通PCR仪下使用COLD-PCR检测混合检材中的微量成分

3.1背景

3.2材料

3.3方法

3.4结果

第4章 实时定量PCR检测技术与COLD-PCR结合检测混合检材中的微量成分

4.1背景

4.2材料

4.3方法

4.4结果

第5章 讨论

5.1 COLD-PCR的原理

5.2 Tc值及其测定

5.3 COLD-PCR程序

5.4 Y-M175基因座COLD-PCR富集分型效果

5.5 EvaGreen荧光染料的选择

5.6法医学应用前景与存在的问题

第6章 结论

第7章 综 述混合检材中的微量等位基因富集技术进展

7.1概要

7.2对已知突变选择性和富集的一般方法

7.3对已知突变有较高选择性和富集的方法

7.4根据突变序列富集未知突变

参考文献

缩略语词汇表

附录A 论文

致谢

攻读硕士学位期间的研究成果