猪源抗菌肽PG-1的表达及其生物活性的初步研究

摘要

抗菌肽是动物天然免疫系统的重要组成部分，可以作为有效的、广泛的、无选择性的第一道防线来防御入侵的病原菌。已经从各种各样的资源中分离得到大量的抗菌肽，包括植物、昆虫、低等脊椎动物和哺乳动物。猪源抗菌肽Protegrin-1(PG-1)最初由猪白细胞中分离得到，包括18个氨基酸，富含二硫键和精氨酸。PG-1的两亲性可以确保它作用于病原菌的细胞膜释放胞内物质导致病原菌死亡，一些试验研究了PG-1的抗菌机理：PG-1单体在大量液体中都会发生二聚化，PG-1可以和磷脂双分子膜紧密结合，特别是阴离子膜，并且可以在磷脂双分子膜中形成孔道造成不可控的离子转运，这是造成细胞死亡的主要因素。同时因PG-1具有广谱的抗菌活性和不易产生耐药性，PG-1被认为是潜在的新药候选者。在本研究中通过毕赤酵母P.pastorisX-33表达抗菌肽PG-1，并对其进行纯化和抗菌抗肿瘤细胞活性研究。
　　本试验根据成熟抗菌肽PG-1的氨基酸序列和P.pastorisX-33的偏好型密码子全基因合成了PG-1基因的核酸序列，并在这段核酸序列上游设计一个Xho I酶切位点，便于这段序列连在信号肽α-factor下游，在基因两端分别添加编码Kex2蛋白酶和6His-tag的核酸序列，在C端添加终止密码子和Xba I酶切位点。并将PG-1基因克隆到真核表达载体pPICZa-A，空质粒和重组质粒分别经限制性内切酶SacI线性化后，电击转化到P.pastorisX-33。
　　选择阳性的酵母重组子接种到BMGY培养基30℃培养24h，当细胞浓度达到OD600为0.6时，收集细胞接种到BMMY培养基中28℃培养4～5天，每隔24h补加甲醇诱导，使甲醇浓度保持在1％。通过Tricine-SDS-PAGE的方法检测培养上清中表达的蛋白，通过Bradrford法测定粗蛋白的含量。将培养上清添加到镍柱中进行纯化，PG-1的洗脱峰通过15% Tricine-SDS-PAGE电泳检测分析，收集含有PG-1的那部分洗脱液，并测定蛋白含量。
　　采用液体生长抑制法测定最小抑菌浓度(MIC)，在96孔板中添加各稀释浓度的样品10μL，然后再添加100μL处于对数期生长的菌体，培养一段时间后通过测定OD600来检测其抑菌效应。通过MTT法测定纯化后抗菌肽PG-1对人肝癌细胞系细胞Hep G2细胞、人食管癌细胞系EC109和人胃癌细胞系MGC803的抑制作用，在96孔板中添加100μL的肿瘤细胞，过夜培养后添加各个浓度的PG-1(10、20、40、80和160μg/mL)，培养1天后，加入20μL的5mg/mL MTT(pH4.7)继续培养4h，吸弃液体，每孔再加150μL DMSO，振荡10min充分融解结晶物，用分光光度仪(BioRad)测定各孔OD490值。
　　本试验成功构建了真核表达载体pPICZa-A-PG-1并通过酶切鉴定和核酸测序进行验证，将重组的载体转化到P.pastorisX-33。Tricine-SDS-PAGE电泳的结果表明抗菌肽得到成功表达，并分泌到培养上清中，且分泌蛋白的分子量大小与预期设计的大小相符。培养上清经镍柱纯化后，500mL培养上清约获得10mg纯的目的蛋白PG-1，纯化后的抗菌肽具有广谱抗性，试验表明低浓度的PG-1对E.coli和Bacillus subtilis具有明显抑制效果，同时PG-1在体外对人肝癌细胞系Hep G2细胞、人食管癌细胞系EC109和人胃癌细胞系MGC803有剂量依赖的抑制作用。本研究为毕赤酵母表达系统制备抗菌肽PG-1的可行性提供了参考，为筛选新型抗菌药物奠定了基础。

目录

第1章 绪论

1.1抗菌肽概述

1.2 抗菌肽的分类

1.3 抗菌肽的生物学活性

1.4 抗菌肽的杀菌机制

1.5 目的抗菌肽简介

1.6 研究意义及主要内容

第2章 抗菌肽PG-1基因的克隆和真核表达载体

2.1实验材料

2.2试验方法

2.3结果与分析

2.4讨论

第3章 抗菌肽PG-1的真核表达及纯化

3.1试验材料

3.2 试验方法

3.3结果和分析

3.4讨论

第4章 PG-1生物学活性的初步研究

4.1试验材料

4.2试验方法

4.3结果和分析

4.4讨论

第5章 结论

5.1 抗菌肽PG-1基因的克隆与表达纯化

5.2 抗菌肽PG-1的生物活性

参考文献

缩略语词汇表

致谢

攻读硕士学位期间研究成果