声明
第1章 绪论
1.1 酒精性肝损伤概述
1.1.1酒精性肝损伤的流行病学
1.1.2 酒精性肝损伤的病理学特点
1.2 酒精性肝损伤机制
1.2.1 酒精及其代谢产物对肝脏的毒作用
1.2.2 氧化应激与酒精性肝损伤
1.2.3 细胞凋亡与酒精性肝损伤
1.3急性酒精性肝损伤模型的制备
1.3热休克蛋白Gp96
1.3.1 热休克蛋白概述
1.3.2 Gp96的分子结构
1.3.3 GP96的功能和应用
1.4 CRISPR/Cas9技术概述
1.4.1 CRISPR/Cas9系统的发现
1.4.2 CRISPR/Cas9系统的结构
1.4.3 CRISPR/Cas9系统的作用机制
1.4.4 CRISPR/Cas9系统应用现状
第2章 前言
第3章 材料与方法
3.1实验材料
3.1.1 细胞
3.1.2 质粒
3.1.3 实验动物
3.1.4 主要仪器设备
3.1.5 主要实验试剂
3.1.6 主要溶液配制
3.2 实验方法
3.2.1实验设计
3.2.2 CRISPR/Cas9技术靶向突变小鼠Gp96基因三合一质粒构建
3.2.3 细菌培养
3.2.4 提取质粒
3.2.5 细胞培养
3.2.6 确定最佳嘌呤酶素浓度
3.2.7细胞转染
3.2.8嘌呤酶素筛选
3.2.9 PCR技术检测：
3.2.10 胶回收DNA
3.3 体外实验
3.3.1 免疫印迹蛋白检测
3.3.2 CCK-8细胞活性检测
3.3.3 Hoechst 33258染色检测细胞凋亡情况
3.4 体内实验
3.4.1 血清AST、ALT酶活性的检测
3.4.2 肝组织蜡块包埋及组织切片制作
3.4.3 HE染色检测各组小鼠的肝脏损伤情况
3.4.4 PAS法检测各组小鼠肝脏中糖原的表达情况
3.4.5 Hoechst 33258染色法检测小鼠的肝细胞凋亡情况
3.4.6 免疫印迹蛋白检测
3.5实验数据的统计学分析
第4章 结果
4.1 CRISPR/Cas9技术靶向突变小鼠GP96基因三合一质粒
4.1.1 设计CRISPR序列
4.1.2 YSY线性化三合一CRISPR/Cas9质粒构建
4.1.3 转化子PCR验证
4.1.4 转化子的测序验证
4.2 细胞转染和sgRNA活性验证
4.2.1 转染效率检测
4.2.2测序筛选sgRNA3 为有效向导RNA
4.2.3 免疫印记验证有效sgRNA3
4.3细胞活性检测结果
4.4细胞Hoechst 33258染色结果
4.5 免疫印迹法检测细胞蛋白表达结果
4.6小鼠血清ALT、AST酶活性的检测结果
4.7 肝脏组织HE染色结果
4.8 肝脏组织PAS染色结果
4.9 肝脏组织Hoechst 33258染色结果
4.10 免疫印迹法检测组织蛋白的表达结果
第5章 讨论
5.1 Gp96与酒精诱导的细胞毒性作用
5.2小鼠急性酒精性肝损伤中Gp96与转氨酶和组织损伤的关系
5.3小鼠急性酒精性肝损伤中Gp96和糖原储备的关系
5.4小鼠急性酒精性肝损伤中Gp96和细胞凋亡的关系
5.5小鼠急性酒精性肝损伤中Gp96对肝细胞应激分子HSP27、HSP70的影响
5.6小鼠急性酒精性肝损伤中Gp96对肝细胞增殖的作用
5.7小鼠急性酒精性肝损伤中Gp96和VEGF的关系
5.8小鼠急性酒精性肝损伤中Gp96和p-STAT3信号途径的关系
5.9小鼠急性酒精性肝损伤中Gp96和CYP2E1的关系
5.10小鼠急性酒精性肝损伤中Gp96和TNF-α的关系
5.11问题与展望
第6章 结论
参考文献
缩略语词汇表
附录Ⅰ图及说明
致谢
攻读学位期间的研究成果
