BCL-2蛋白高表达PC12细胞系的建立及其对酒精诱导细胞凋亡效应的研究

摘要

目的:克隆小鼠BCL-2基因全长cDNA，构建真核表达载体pcDNA3.1(-)-bcl-2，并建立高表达BCL-2蛋白的PC12细胞，为研究BCL-2蛋白在酒精诱导PC12细胞凋亡中的作用提供依据。
　　 方法:从小鼠脾脏中提取总RNA，采用RT-PCR方法克隆BCL-2的cDNA，DNA琼脂糖凝胶电泳检测产物并回收BCL-2基因。将全长BCL-2基因与pMD-19T载体连接，经蓝白斑筛选、克隆、转化、提取质粒，经PCR及菌液DNA测序鉴定，检测BCL-2基因的准确性并检测是否成功重组质粒pMD19-T-bcl-2。用HindⅢ和EcoRⅠ两种限制性内切酶对质粒pcDNA3.1(-)和重组质粒pMD19-T-bcl-2DNA进行酶切，切割产物经1％的DNA琼脂糖凝胶电泳分离后，用T4DNA连接酶将所需片段连接，转化、克隆、提取细菌质粒DNA，双酶切鉴定确定真核表达载体pcDNA3.1(-)-bcl-2是否构建成功。采用稳定转染的方法将真核表达载体转染至PC12细胞，经G418筛选，分别从PC12细胞、转染空载体pcDNA3.1(-)的PC12细胞和转染了真核表达载体的PC12细胞提取细胞总RNA，采用RT-PCR的方法检测细胞BCL-2基因mRNA的表达，应用Western-blot的方法检测BCL-2蛋白的表达。MTT法测定不同浓度酒精(100mmoL/L、200mmoL/L、400mmoL/L)对三种PC12细胞增殖的影响。
　　 结果:从小鼠脾脏获得较纯的RNA，RT-PCR方法获得到BCL-2基因产物。BCL-2基因和pMD-19T载体连接后，经PCR和菌液测序证实，BCL-2基因正确且已和pMD-19T载体成功连接，得到重组质粒pMD19-T-bcl-2。双酶切质粒pMD19-T-bcl-2和peDNA3.1(-)DNA并经T4DNA连接酶连接所需片段后，构建出真核表达载体pcDNA3.1(-)-bcl-2。从3种不同的PC12细胞得到纯度较高的RNA，经RT-PCR和Western-blot分别检测BCL-2mRNA和蛋白的表达，结果显示成功建立了高表达BCL-2蛋白的PC12细胞系。MTT结果表明，100mmol/L和200mmol/L酒精浓度时，BCL-2高表达的PC12细胞组的生存率显著高于对照组(P<0.01，P<0.05)，酒精浓度为400mmol/L时，两组生存率差异不具有统计学意义(P>0.05)。BCL-2蛋白在酒精浓度为100～200mmol/L范围内，对酒精诱导PC12细胞的损伤及凋亡的有保护作用。
　　 结论:1.利用pMD-19TVector成功构建出pcDNA3.1(-)-bcl-2真核表达载体，转染PC12细胞后，表达高水平BCL-2mRNA和蛋白质。
　　 2.高表达BCL-2的PC12细胞能在一定浓度范围内抵抗酒精对细胞凋亡的诱导作用。