染料木素通过JNK调控Fas和Bcl-2家族抑制Aβ诱导PC12细胞凋亡的机制研究

摘要

染料木素（genistein，Gen）是大豆异黄酮的主要活性成份。Gen作为植物雌激素，与雌激素相比，在发挥神经保护作用的同时没有对非神经细胞的致癌等副作用。Gen的神经保护作用受到持续关注。我们前期的研究发现，Gen可增强PKC的活性，调节α-/β-分泌酶活性，减少不溶性Aβ沉积，并逆转Aβ诱导的Bcl-2的下调和Bax的上调，降低细胞的凋亡程度，最终显著提高Aβ刺激的PC12细胞的活力。目前，有关 Gen的神经保护效应及其机制逐渐深入，但其分子保护机制及其相关的信号仍有待进一步阐明。本论文继续探讨Gen体外水平的抗Aβ神经保护机制及其分子机制。具体内容如下：
　　1. Gen对Aβ诱导PC12细胞损伤的细胞活力、凋亡染色、凋亡率的研究：MTT细胞活力测定结果显示，0-25μM的Gen对细胞活力几无影响，而50和100μM Gen使细胞存活率显著降低，Aβ显著降低PC12细胞存活率的最小剂量是20μM，0-100μM的Gen都显著提高Aβ处理的PC12细胞存活率，而25μM的Gen具有最大保护效应；Hoechst33342凋亡染色结果表明，与对照组相比，Aβ诱导的PC12细胞有明显的凋亡细胞特征，其凋亡细胞比例显著多于对照组，而Gen处理组（12.5、25、50和100μM）显著减少凋亡细胞的比例；Annexin V-FITC双染法检测细胞凋亡率结果显示，Aβ组显著高于对照组，且Gen作用组（12.5、25、50和100μM）都显著抑制Aβ诱导的细胞凋亡，但25μM剂量的Gen具有最大抑制效应。
　　2. qPCR和Western blot检测Gen对Aβ诱导PC12细胞Fas和FasL mRNA和蛋白表达的影响：qPCR结果显示，Aβ诱导组显著增加FasL的表达，温和上调Fas的表达，Gen显著抑制Aβ诱导的Fas和FasL mRNA的增加；Westernblot结果显示，Aβ组显著增加Fas和FasL的表达，Gen显著抑制Aβ诱导的Fas和FasL蛋白水平的增加。
　　3. qPCR和Western blot检测Gen对Aβ诱导PC12细胞Bcl-w和BimmRNA和蛋白表达的影响：qPCR结果显示，Aβ组显著减少Bcl-w和增加Bim的表达，Gen可逆转Aβ诱导的Bcl-w和Bim的变化；Western blot结果与qPCR结果一致。
　　4.Western blot检测Gen对Aβ诱导PC12细胞质中Cyt C和Smac蛋白表达的影响：结果显示，Gen可逆转Aβ刺激引起Cyt C和Smac从线粒体到细胞质的释放。
　　5. qPCR和分光光度法检测Gen对Aβ诱导PC12细胞Caspase-3和Caspase-8 mRNA和酶活力的影响：结果显示，Gen可抑制Aβ诱导Caspase-3和Caspase-8 mRNA的增加；Caspase-3和Caspase-8酶活性测定进一步证实了Gen对Aβ诱导细胞Caspase-3和Caspase-8的抑制作用。
　　6.采用JNK-siRNA和磷酸化抑制剂SP600125干扰JNK，检测Aβ诱导PC12细胞 Fas和FasL mRNA和蛋白表达的变化：结果表明，Gen、JNK-siRNA和SP600125均对Aβ刺激引起的Fas和FasL mRNA和蛋白水平表达有抑制作用，Gen与JNK-siRNA/SP600125合用效果最强。
　　7.采用JNK-siRNA和磷酸化抑制剂SP600125干扰JNK，检测Aβ诱导PC12细胞Bcl-w和Bim mRNA和蛋白表达的变化：结果表明，Gen、JNK-siRNA和SP600125均对Aβ刺激引起的Bcl-w和Bim mRNA和蛋白水平表达有抑制作用，Gen与JNK-siRNA/SP600125合用效果最强。
　　8.采用JNK-siRNA和磷酸化抑制剂SP600125干扰JNK，检测Aβ诱导PC12细胞质中Cyt C和Smac蛋白表达的变化：结果表明，Gen、JNK-siRNA和SP600125均对Aβ刺激引起的Cyt C和Smac蛋白表达有抑制作用，Gen与JNK-siRNA/SP600125合用效果最强。
　　9.采用JNK-siRNA和磷酸化抑制剂SP600125干扰JNK，检测Gen对Aβ诱导PC12细胞Caspase-3和Caspase-8 mRNA和酶活力的影响：结果表明，Gen、JNK-siRNA和SP600125均对Aβ刺激引起的Caspase-3和Caspase-8 mRNA和酶活力有抑制作用，Gen与JNK-siRNA/SP600125合用效果最强。
　　10.Westernblot检测Gen对Aβ诱导PC12细胞p-JNK和JNK蛋白表达的影响：结果表明，Aβ显著诱导PC12细胞p-JNK54和46 kDa条带，而Gen可显著减弱p-JNK54和46 kDa条带，Gen+SP600125合用效果最强。
　　研究结果表明，JNK-siRNA和SP600125均对Aβ刺激引起Fas介导凋亡途径和线粒体凋亡途径有抑制作用，暗示JNK参与调节Aβ诱导PC12细胞Fas介导的和线粒体起始的凋亡途径，而Gen显著抑制Aβ诱导的JNK磷酸化的结果表明，Gen可能通过对Aβ诱导的JNK依赖的Fas和线粒体凋亡通路的抑制，从而抑制Aβ诱导的PC12细胞凋亡，发挥神经保护作用。然而，Gen与JNK-siRNA或JNK抑制剂SP600125合用组的结果表明，Gen针对Aβ诱导的Fas和线粒体凋亡通路的抗凋亡效应可能只是 Gen多靶点抗凋亡效应的其中之一，其神经保护机制有待进一步被阐明。

目录

声明

目录

中文摘要

英文摘要

前言

一 AD及研究策略概况

1 AD以及分子病理机制概述

2 针对AD的研究策略

二 凋亡与AD

1 Aβ与神经细胞凋亡

2 PS突变与神经细胞凋亡

3 Ca2+失衡与神经细胞凋亡

三 Gen神经保护作用研究概况

1 直接与Aβ结合

2 抗氧化作用

3 抑制Ca2+超载及兴奋性毒性损伤

4 抑制炎症反应

5 激活受体

四 本研究的目的和意义

第一部分 染料木素抑制Aβ诱导PC12细胞凋亡的研究

一、材料与方法

1 实验材料

2 实验方法

二、结果

1 Gen对Aβ诱导PC12细胞损伤的细胞活力影响

2 Hoechst 33342染色观察Gen对Aβ诱导PC12细胞凋亡的形态影响

3 Annexin V-FITC流式细胞仪检测Gen对Aβ诱导PC12细胞凋亡率的影响

三、讨论

第二部分 染料木素抑制Aβ诱导PC12细胞凋亡的研究

一、材料与方法

1 实验材料

2 实验方法

二、结果

1Gen对Aβ诱导PC12细胞Fas和FasL mRNA和蛋白表达的影响

2Gen对Aβ诱导PC12细胞Bcl-w和Bim mRNA和蛋白表达的影响

3Gen对Aβ诱导PC12细胞Cyt C和Smac蛋白表达的影响

4Gen对Aβ诱导PC12细胞Caspase-3和Caspase-8 mRNA和酶活力的影响

三、讨论

第三部分 JNK信号在染料木素对Aβ诱导PC12细胞凋亡抑制的作用研究

一、材料与方法

1 实验材料

2 实验方法

二、结果

1 JNK-siRNA和SP600125对Gen调节Aβ诱导的PC12细胞Fas和FasL mRNA和蛋白表达的影响

2 JNK-siRNA和SP600125对Gen调节Aβ诱导的PC12细胞Bcl-w和Bim mRNA和蛋白表达的影响

3 JNK-siRNA和SP600125对Gen调节Aβ诱导的PC12细胞Cyt C和Smac蛋白表达的影响

4 JNK-siRNA和SP600125对Gen调节Aβ诱导的PC12细胞Caspase-3和Caspase-8 mRNA表达和酶活力的影响

5 Gen对Aβ诱导PC12细胞JNK磷酸化水平的影响

三、讨论

总结

参考文献

主要英文缩写词表

攻读硕士期间发表的论文

致谢