穿心莲内酯衍生物ADS体外抗肿瘤作用机制研究

摘要

穿心莲Andrographis paniculata(Burm.f.)Nees为我国传统中草药，具有清热解毒，凉血消肿之功效。近年来的研究表明以穿心莲内酯为代表的二萜内酯类成分具有广谱的抗癌活性，本课题组合成了穿心莲内酯衍生物ADS，体内抗肿瘤作用研究发现其抗肿瘤活性显著。
　　本课题拟研究ADS对小鼠乳腺癌4T-1细胞和小鼠肺癌LLC细胞的增殖抑制作用，并对其抗肿瘤分子机制进行探讨。
　　课题采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测ADS对4T-1和LLC细胞增殖的影响，碘化丙啶(PI)染色法流式细胞仪测定ADS对细胞周期的影响，光学显微镜下观察细胞凋亡的形态学变化，吖啶橙/溴乙啶(AO/EB)双染法和PI/Hoechst33258荧光染色法高内涵检测ADS对细胞凋亡的影响，罗丹明123(Rh123)/Hoechst33258双染法高内涵检测细胞凋亡时线粒体膜电位的变化，免疫蛋白印迹法检测凋亡通路中相关蛋白caspases-3，caspases-9，Bcl-2，Bax及细胞色素C(Cyto c)等的表达。
　　MTT法检测结果显示，ADS对4T-1和LLC细胞增殖均有明显的生长抑制作用，并呈时间、剂量依赖性，与空白对照组相比有显著性差异，对4T-1细胞的IC50值是(5.5±1.36)μM(24 h)和(4.4±0.93)μM(48 h)，对LLC细胞的IC50值是(4.12±1.27)μM(24 h)和(5.15±1.01)μM(48 h)，对于两种细胞的抗肿瘤作用均强于穿心莲内酯A。
　　PI染色法检测细胞周期结果显示，3.2μM ADS即可诱导4T-1细胞周期阻滞于G2/M期，细胞比例（22.44±0.7）％与空白对照组（7.95±0.1）％相比有非常显著性差异;1.8μMADS可诱导LLC细胞周期阻滞于G0/G1期，细胞比例（55.44±2.7）％与空白对照组(35.52±3.9)％相比有显著性差异，而2.5μM ADS、3.0μM ADS诱导LLC细胞周期阻滞于G2/M期，细胞比例分别为（14.4±0.8）％、（16.13±1.6）％与空白对照组（6.41±0.6）％相比均有显著性差异。
　　光学显微镜下观察结果显示，2μM左右ADS作用24 h后，4T-1和LLC细胞呈现细胞凋亡的形态学特征，如细胞皱缩变圆、碎裂、形成“凋亡小体”等。
　　AO/EB和PI/Hoechst33258免疫荧光染色后结果显示，空白对照组细胞核成正常形态，ADS处理组染色质固缩，细胞核呈致密浓染或呈致密浓染的碎块状，并呈现剂量依赖性。
　　采用Rh123/Hoechst33342双染法对线粒体膜电位进行检测，高内涵检测结果显示，ADS作用可导致4T-1和LLC细胞线粒体膜电位发生降低，并呈现剂量依赖性。
　　免疫蛋白印迹法检测结果表明，ADS作用引起了caspases家族的活化，caspases-3，caspases-9与细胞色素C的表达增多，Bcl-2家族也参与了凋亡的过程，Bcl-2表达减少，Bax表达增多。
　　本课题研究发现ADS对4T-1和LLC细胞增殖均有明显的生长抑制作用，并能诱导细胞周期阻滞，通过激活线粒体途径诱导细胞凋亡。

目录

声明

摘要

附录A：中英文缩略词表

第1章 前言

1．细胞周期与细胞凋亡

1．1 细胞周期的调控与肿瘤治疗

1．2 细胞凋亡的调控与肿瘤治疗

2．天然萜类化合物抗肿瘤作用研究进展

2．1 倍半萜类化合物抗肿瘤活性研究进展

2．2 二萜类化合物抗肿瘤活性研究进展

3．穿心莲内酯及其衍生物抗肿瘤作用研究进展

3．1 穿心莲内酯及其衍生物的细胞毒作用

3．2 穿心莲内酯及其衍生物对细胞周期的阻滞作用

3．3 穿心莲内酯及其衍生物对细胞凋亡的诱导作用

3．4 穿心莲内酯及其衍生物对肿瘤血管生成的抑制作用

3．5 穿心莲内酯及其衍生物对细胞自噬的诱导作用

3．6 穿心莲内酯及其衍生物的免疫调节作用

3．7 穿心莲内酯及其衍生物对NF-κB活性的抑制作用

4．选题依据

第2章 ADS对小鼠乳腺癌4T-1细胞和小鼠肺癌LLC细胞增殖的影响

1．实验材料

1．1 肿瘤细胞株

1．2 实验仪器

1．3 药品与试剂

1．4 药品与主要试剂的配制方法

2．实验方法

2．1 细胞培养

2．2 ADS对肿瘤细胞增殖的影响

2．3 统计学处理

3．实验结果

3．1 ADS对4T-1细胞增殖的影响

3．2 ADS对LLC细胞增殖的影响

4．小结

第3章 ADS对小鼠乳腺癌4T-1细胞和小鼠肺癌LLC细胞周期的影响

1．实验材料

1．1 肿瘤细胞株

1．2 实验仪器

1．3 药品与试剂

1．4 药品与主要试剂的配制方法

2．实验方法

2．1 细胞培养

2．2 PI染色法测定ADS对肿瘤细胞周期的影响

2．3 统计学处理

3．实验结果

3．1 ADS对4T-1细胞周期的影响

3．2 ADS对LLC细胞周期的影响

4．小结

第4章 ADS对小鼠乳腺癌4T-1细胞和小鼠肺癌LLC细胞凋亡的影响

1．实验材料

1．1 肿瘤细胞株

1．2 实验仪器

1．3 药品与试剂

1．4 药品与主要试剂的配制方法

2．实验方法

2．1 光学显微镜下观察细胞凋亡形态

2．2 AO／EB双染法检测细胞凋亡

2．3 PI／Hoechst33258双染法检测细胞凋亡

2．4 Rh123染色法检测细胞线粒体膜电位

2．5 免疫蛋白印迹法检测ADS诱导的凋亡相关蛋白的表达

2．6 统计学处理

3．实验结果

3．1 光学显微镜下观察细胞凋亡形态

3．2 AO／EB双染法检测细胞凋亡结果

3．3 PI／Hoechst33258双染法检测细胞凋亡结果

3．4 ADS对细胞线粒体膜电位的影响

3．5 ADS对细胞线粒体凋亡通路相关蛋白表达的影响

4．小结

第5章 讨论与结论

参考文献

致谢

参与项目