创伤治愈微环境抑肺癌机制与药物治疗

摘要

肿瘤的发生发展与肿瘤微环境密切相关，肿瘤被称为永不愈合的创伤。创伤修复过程与肿瘤发生发展过程在信号传导方面有很多相同之处，创伤修复一直被认为是促癌因素之一。然而，创伤治愈是组织器官恢复功能的必要条件，是否治愈创伤能够阻止肿瘤发展未有报道。基于中医―创伤治愈需元气充足的观点，我们提出―创伤治愈微环境可以阻止癌症的发生。为验证此科学假设的正确性，我们开展了创伤治愈微环境抑肺癌机制与药物治疗研究。
　　本研究首先用小鼠全层皮肤切除创伤模型筛选出有创伤愈合作用的药物，通过血流灌注量、小鼠耳肿胀抗炎模型、巨噬细胞的吞噬作用观察药物治疗创伤的特点，根据药物作用特点进行创伤愈合药物组合。接着，我们用创伤愈合药物组合体外处理 A549、BEAS-2B和L929细胞，MTT法检测细胞增殖；划痕标记染料示踪法观察细胞连接通讯功能；软琼脂克隆实验和细胞成球实验检测细胞自我更新能力。最后，我们采用乌拉坦诱导小鼠肺癌模型观察创伤愈合药物组合营造的创伤治愈微环境对小鼠肺癌发展的影响，体重和自主活动检测考察药物组合对小鼠正常生理的影响；肺部病理变化、肺癌发生率及肺肿瘤结节数检测药物组合对肿瘤发生的影响；免疫组化检测细胞增殖标记物ki67及凋亡相关标志物cleaved caspase-3；Western blot检测肿瘤干细胞标志物Oct4及Nanog，细胞通讯标志物细胞间隙连接蛋白Connexin43，上皮-间充质转化标志物 E-钙粘蛋白，N-钙粘蛋白及波形蛋白。另外，为了进一步探索创伤治愈微环境抑制肿瘤发展的机制，我们在乌拉坦诱导小鼠肺癌模型中用脂多糖气管滴注，氯屈膦酸钠脂质体腹腔注射，博来霉素气管滴注观察了肺炎症、肺巨噬细胞耗竭和肺损伤对肺癌发展及药物组合的影响，重点用ELISA试剂盒检测细胞炎症标志物肿瘤坏死因子α（TNFα）、髓过氧化物酶（MPO），和细胞损伤标志物活性氧（ROS）、8-羟基脱氧鸟苷（8-OHdG）。实验表明，在筛选的药物中，乌头碱，紫草素和三七皂苷R1较快的促进了小鼠全层皮肤切除创伤愈合；三七皂苷R1及乌头碱在激光散斑仪检测中增加了创伤局部的血流灌注量；仅紫草素对TPA引起的小鼠耳肿胀有显著的抑制作用；而三七皂苷R1及乌头碱在巨噬细胞吞噬实验表现了吞噬能力增强作用。因此，我们将三个药物组合成创伤治愈复合物营造创伤治愈微环境用于体内外观察创伤治愈微环境对肿瘤发展的影响。在体外实验中，0.2μM~1μM紫草素能抑制ECV304细胞增殖；2μM~10μM三七皂苷R1抑制L929细胞增殖而促进了ECV304的增殖，0.02μM~0.1μM乌头碱促进了L929的增殖，而三个药物组合促进了L929细胞和ECV304细胞的增殖而并不抑制A549增殖。药物组合恢复了乌拉坦导致的BEAS-2B细胞间连接通讯减少，减少了A549肿瘤细胞的软琼脂克隆和干细胞成球数量。在乌拉坦诱导的小鼠肺癌模型中，0.2mg/kg乌头碱，2mg/kg紫草素，20mg/kg三七皂苷R1对乌拉坦化学诱导小鼠肺癌模型肺癌的预防率分别为50％，30%及35%，药物组合预防率可高达90%。病理结果显示三个药物单独使用虽然均能一定程度改善致癌小鼠肺组织病理变化，三者联合用药可使致癌小鼠肺组织病理变化恢复到接近正常。免疫组化结果显示药物组合能显著下调ki67和上调Cleaved Caspase-3的表达。Western实验结果显示，药物组合可以下调干细胞标志物Oct4，Nanog的表达，增加连接蛋白Connexin43， E-钙粘蛋白表达，减少 N-钙粘蛋白，波形蛋白表达。另外，我们发现脂多糖气管滴注主要增加肺脏MPO及TNFα，对小鼠肺癌并无明显促进作用；博来霉素气管滴注以增加肺脏中ROS和8-OHdG为主，同时促进了肺癌发生；而氯屈磷酸钠脂质体在致癌前耗竭巨噬细胞表现出降低 MPO及 TNFα的抗炎作用和增加ROS及8-OHdG的促肺损伤作用，也促进肺癌发生。值得注意的是，在三种处理方式下，药物组合物营造的损伤治愈微环境肺癌防治作用均降低。

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第一章 绪论

第二章 促进创伤治愈药物的筛选

2.1 前言

2.2 实验材料

2.3 实验方法

2.4 实验结果

2.5 实验小结

第三章 体外创伤治愈微环境抑肺癌作用研究

3.1 前言

3.2 实验材料

3.3 实验方法

3.4 实验结果

3.5 实验小结

第四章 体内创伤治愈微环境抑肺癌作用研究

4.1 前言

4.2 实验材料

4.3 实验方法

4.4 实验结果

4.5 实验小结

第五章 创伤治愈微环境抑肺癌作用机制研究

5.1 前言

5.2 实验材料

5.3 实验方法

5.4 实验结果

5.5 实验小结

第六章 讨论

第七章 结论

第八章 创新性总结

参考文献

致谢

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