肿瘤细胞间质液微环境促肺癌机制和药物治疗

摘要

肿瘤的发生和发展必须有充足的营养供给，一般认为肿瘤的营养供给依赖于新生血管形成。然而，众所周知肿瘤新生血管具有畸形高通透性的特点，这种畸形新生血管很难完成充足的营养供给，临床上抗新生血管形成“饿死”肿瘤的疗法不仅没有达到预期的效果，甚至使肿瘤更加恶化的现象也证实了这个观点。相反，肿瘤细胞间质液因含有丰富的营养和细胞生长因子，恰好能够沐浴和支持肿瘤细胞生长，有可能是肿瘤发展的直接和主要营养来源，因此对肿瘤细胞间质液促癌作用的认识是肿瘤防治成功的关键。本研究以肺癌为研究对象探索肿瘤细胞间质液微环境促进肺癌发生和发展的机制以及相关的药物治疗，以期为肺癌防治提供有效的措施和方法。
　　本研究首先从肿瘤组织中分离肿瘤细胞间质液并进行蛋白定量得到10μg蛋白质/毫升的肿瘤细胞间质液用于体内和体外试验。体外试验我们用肿瘤细胞间质液处理 LLC细胞，流式细胞术检测肿瘤干细胞标志物CD133、Nanog和PCNA的表达，软琼脂克隆形成和细胞成球实验检测肿瘤细胞自我更新，MTT法检测肿瘤细胞增殖，免疫荧光技术检测肿瘤细胞上皮间质转化，细胞划痕实验检测肿瘤细胞迁移，Transwell实验检测肿瘤细胞侵袭，AO/EB荧光双染法检测肿瘤细胞自噬和凋亡。接着，我们采用气管滴注方式建立了小鼠原位肺癌共移植模型，通过免疫组化和Western Blot检测肺癌小鼠肺组织中肿瘤干细胞标志物Nanog，细胞增殖标志物PCNA，细胞水运载标志物水通道蛋白1，新生血管形成标志物CD31，低氧标志物低氧诱导因子HIF-1和碳酸酐酶IX，及上皮间质转化标志物N-cadherin、E-cadherin、Vimentin和Cytokeratin18表达；同时，用伊文斯兰通透性和干湿重法检测肺癌小鼠肺组织血管通透性和肺组织含水量；用 ELISA试剂盒检测肺癌小鼠血清中血管紊乱标志物5-HIAA，糖酵解标志物 ROS、Lactate和Pyruvate，炎症标志物8-OHdG、TNF-α和hs-CRR。另外，我们用新生血管形成抑制剂Vadimezan、抗炎药物地塞米松、Na-K-ATP酶抑制剂地高辛、以及醛固酮受体阻断剂螺内酯治疗肿瘤细胞间质液共移植肺癌小鼠，观察其对肿瘤细胞间质液形成、新生血管形成、血管通透性及肿瘤生长的影响。体外试验结果表明，肿瘤细胞间质液处理后的LLC细胞肿瘤干细胞标志物CD133、Nanog和PCNA的表达增加，肿瘤细胞软琼脂克隆和细胞成球实验的克隆数增多，上皮间质转化增加，饥饿诱导的肿瘤细胞自噬和凋亡减少。小鼠原位癌实验结果显示，肿瘤细胞间质液与肿瘤细胞共移植后小鼠肺癌发生率升高，肺部肿瘤结节数增多，肺组织血管通透性增强，肺组织含水量增加；肺组织肿瘤干细胞标志物Nanog，细胞增殖标志物PCNA，细胞水运载标志物水通道蛋白1，低氧标志物低氧诱导因子 HIF-1和碳酸酐酶IX，及上皮间质转化标志物N-cadherin和Vimentin表达升高，E-cadherin和Cytokeratin18表达降低；炎症标志物、糖酵解标志物和氧化损伤标志物水平升高；新生血管形成标志物 CD31的表达没有显著变化。有趣的是，炎症反应抑制剂地塞米松、Na-K-ATP酶抑制剂地高辛和醛固酮受体阻断剂螺内酯能够降低肿瘤细胞间质液诱导的肺癌发生率，减少肺癌小鼠肺部肿瘤结节数，增加新生血管形成标志物CD31表达但降低血清中血管紊乱标志物5-HIAA水平；新生血管形成抑制剂Vadimezan虽然降低新生血管形成标志物CD31表达，却增加血清中5-HIAA水平，提高肺癌发生率，增加肺癌小鼠肺部肿瘤结节数；另外，我们发现肿瘤组织含水量升高时组织中5-HIAA和水通道蛋白1的表达增加，但是组织中CD31的表达无明显变化。

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第一章 引言

第二章 肿瘤细胞间质液体外促肺癌作用研究

2.1 前言

2.2实验材料

2.3实验方法

2.4 实验结果

2.5 实验小结

第三章 肿瘤细胞间质液体内促肺癌作用研究

3.1 前言

3.2 实验材料

3.3 实验方法

3.4 实验结果

3.5 实验小结

第四章 肿瘤细胞间质液促肺癌作用机制研究

4.1 前言

4.2 实验材料

4.3 实验方法

4.4 实验结果

4.5 实验小结

第五章 讨论

第七章 论文创新性

参考文献

致谢

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