靶向EGFRvIII嵌合抗原受体修饰T细胞抗肿瘤试验研究

摘要

背景：嵌合抗原受体（chimeric antigen receptor, CAR）修饰T细胞作为一种新兴的肿瘤过继免疫治疗（adoptive immunotherapy，AIT）新策略，近年来得到了快速发展，其能够重塑T细胞的靶向性、增殖性及持久性，攻克肿瘤病灶的免疫抑制微环境，破坏宿主免疫耐受状态，从而显著增强其特异性肿瘤杀伤作用。表皮生长因子受体III型突变体（epidermal growth factor receper variant III，EGFRvIII），与肿瘤的发生、发展紧密相关，在正常组织不表达，却在恶性肿瘤如脑胶质瘤等细胞表面特异性表达，从而成为靶向肿瘤治疗的完美靶点。本研究以磷酸钙沉淀法包装制备、蔗糖超速离心法浓缩LV-EGFRvIII/3G-CAR，感染采集自健康成人新鲜外周静脉血的、Dynabeads-CD3 Beads分离的及Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28激活扩增的CD3+T细胞，通过共培养EGFRvIII/3G-CAR+CD3+T细胞、EGFRvIII+U87细胞，验证EGFRvIII/3G-CAR+CD3+T细胞选择性杀伤作用，为恶性肿瘤如脑胶质瘤等探索新的靶向治疗策略。
　　目的：LV-EGFRvIII/3G-CAR感染体外分离、激活、扩增后的健康成人新鲜外周静脉血CD3+T细胞，共培养EGFRvIII+U87细胞、EGFRvIII/3G-CAR+CD3+T细胞，检验EGFRvIII/3G-CAR+CD3+T细胞对EGFRvIII+U87细胞的特异性杀伤效应。
　　方法：⑴磷酸钙沉淀法把pCDH-EGFRvIII/3G-CAR载体质粒、pVSVG包膜蛋白质粒及pDel8.9包装质粒共转染293T细胞包装制备慢病毒LV-EGFRvIII/3G-CAR，蔗糖超速离心法浓缩LV-EGFRvIII/3G-CAR，有限稀释法测定LV-EGFRvIII/3G-CAR滴度。⑵Dynabeads? CD3 Beads分离健康人外周血CD3+T细胞，Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28激活、扩增CD3+T细胞，LV-EGFRvIII/3G-CAR感染CD3+T细胞。⑶FASC法检测CD3+T细胞表面EGFRvIII/3G-CAR的表达水平，Western blot检测CD3+T细胞中EGFRvIII/3G-CAR的表达水平。⑷ELISA法检测EGFRvIII/3G-CAR+CD3+T细胞中细胞因子IFN-γ的分泌水平，51Cr释放法检测EGFRvIII/3G-CAR+CD3+T细胞对EGFRvIII+U87细胞的体外杀伤效应。
　　结果：①慢病毒LV-EGFRvIII/3G-CAR滴度高达1.2x108TU/ml，CD3+T细胞的LV-EGFRvIII/3G-CAR感染率达73.65％，LV-EGFRvIII/3G-CAR成功转入CD3+T细胞进行转录翻译。②EGFRvIII/3G-CAR+CD3+T细胞、EGFRvIII+U87细胞共培养24h后，检测到明显的IFN-γ细胞因子释放，高达(1902.7±96.23)pg/ml，存在统计学意义（P﹤0.01）；EGFRvIII/3G-CAR+CD3+T细胞能够特异性杀伤EGFRvIII+U87细胞，杀伤作用与E/T值呈正比关系；且在相同E/T值时，与GFP+T细胞、EGFRvIII/3G-CAR-T细胞相比， EGFRvIII/3G-CAR+CD3+T细胞对EGFRvIII+U87细胞的杀伤作用存在统计学差异（F值前者为2273.9，后者为2232.1，P﹤0.01）；EGFRvIII/3G-CAR+CD3+T细胞的IFN-γ分泌及特异性杀伤EGFRvIII+U87细胞效应，依赖于EGFRvIII在U87细胞中的表达水平。
　　结论：慢病毒LV-EGFRvIII/3G-CAR包装制备成功，感染CD3+T细胞后EGFRvIII/3G-CAR有效表达， EGFRvIII/3G-CAR+CD3+T细胞能特异性杀伤体外EGFRvIII+U87细胞，为后续动物试验及体内试验提供依据。

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英文缩略词表

前言

1 材料、试剂、仪器

1.1 试验材料

1.2 试验试剂/试剂盒

1.3 溶液配制

1.4 仪器

2 方法与步骤

2.1 慢病毒LV-EGFRvIII/3G-CAR的包装与滴度测定

2.2Dynabeads?CD3 Beads分离健康人外周血CD3+T细胞

2.3 激活、扩增CD3+T细胞

2.4 LV-EGFRvIII/3G-CAR感染CD3+T细胞

2.5 CD3+T细胞表面EGFRvIII/3G-CAR的表达（FACS法）

2.6CD3+T细胞中EGFRvIII/3G-CAR的表达（Western blot法）

2.7 EGFRvIII/3G-CAR+T细胞中细胞因子IFN-γ分泌水平的检测（ELISA法）

2.8 EGFRvIII/3G-CAR+T细胞的细胞毒性检测（51Cr释放法）

3 结果

3.1 LV-EGFRvIII/3G-CAR的包装与滴度测定

3.2Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28扩增CD3+T细胞

3.3 CD3+T细胞表面EGFRvIII/3G-CAR的表达

3.4 CD3+T细胞中EGFRvIII/3G-CAR的表达

3.5 CD3+T细胞的IFN-γ分泌

3.6 CD3+T细胞的体外杀伤作用

4 讨论

4.1 确定基因转导方法

4.2 研究EGFRvIII/3G-CAR+CD3+T细胞功能

结论

参考文献

综述:表皮生长因子受体Ⅲ型突变体(EGFRvIII)与肿瘤免疫治疗

致谢

学位攻读阶段论文的发表