酿酒酵母CCR4-NOT蛋白复合体纯化、鉴定与结构研究

摘要

CCR4-NOT蛋白复合体是高度保守的多功能复合体，在基因表达调节过程中发挥重要作用。在细胞核中，该蛋白复合体主要参与染色质修饰、转录延伸、转录偶联过程中 DNA损伤修复等。在细胞质中，该复合物作为重要的去酰基化酶，在 mRNA的衰变、转录抑制和转录后调节过程中的翻译抑制起重要作用。此外，CCR4-NOT蛋白复合体也具有E3泛素连接酶活性，参与蛋白质降解。
　　CCR4-NOT蛋白复合体是独特的多亚基复合体。在酵母中，至少含有九种核心亚基：CCR4、CAF1、CAF40、CAF130和五种NOT蛋白(NOT1-5)，存在1.0 MDa和2.0 MDa两种不同组成形式。在CCR4-NOT蛋白复合体结构中，NOT1蛋白作为支架蛋白，结合复合体中其他蛋白亚基，形成稳定的复合物。以 NOT1蛋白为诱饵，获得的低分辨率的电镜重构图显示，复合体的两臂近似 L-型。该蛋白复合体有两个酶催化组件：CCR4蛋白和CAF1蛋白相互作用，形成一个二元复合体，结合在NOT1蛋白的N末端区域，从而形成一个脱腺苷化组件；NOT2蛋白、NOT3蛋白、NOT4蛋白和NOT5蛋白都结合在NOT1蛋白的C末端区域，形成一个NOT组件。
　　本课题期望通过优化蛋白质纯化条件，得到更稳定、均一的高纯度酵母CCR4-NOT蛋白核心复合体，并制备高质量的冷冻电镜样品，收集高质量的冷冻电镜数据，最终确定CCR4-NOT蛋白核心复合体高分辨率空间结构模型，为深入分析CCR4-NOT蛋白复合体的生物学功能奠定结构信息基础。
　　本课题利用从EUROSCARF公司购买的酿酒酵母表达CCR4-NOT蛋白复合体，该复合体成员的NOT1蛋白N末端带有TAP标签。通过活化菌株以及酵母生长曲线的测定，在OD600吸光值为4-5左右收集菌体。采用高压破碎，IgG Sepharose TM6 Fast Flow亲和层析，钙调素亲和层析，蔗糖密度梯度离心等方法，纯化CCR4-NOT蛋白复合体。对纯化后的样品，进行western blot检测和质谱验证，制作负染电镜样品和冷冻样品。收集负染电镜数据，用EMAN2软件做二维平均观察初步结构信息，再通过三维重构，解析结构。
　　本课题经过反复尝试，确定可以得到CCR4-NOT蛋白复合体的纯化方法，并初步获得了该复合体的低分辨率的电镜结构。

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1 前 言

1.1 CCR4-NOT蛋白复合体概述

1.2 CCR4-NOT蛋白复合体的鉴定

1.3 CCR4-NOT蛋白复合体的结构研究

1.3.1 CCR4-NOT蛋白复合体的成员的一级结构

1.3.2 CCR4-NOT蛋白复合体的三维结构研究

1.4 CCR4-NOT蛋白复合体的功能研究

1.4.1 CCR4-NOT蛋白复合体的脱腺苷化功能

1.4.2 CCR4-NOT蛋白复合体的泛素化功能

1.4.3 CCR4-NOT蛋白复合体的在转录上功能

1.4.4 CCR4-NOT蛋白复合体的其他方面的功能研究

1.5 结构生物学研究方法

1.5.1 核磁共振技术

1.5.2 X射线晶体学

1.5.3 冷冻电镜单颗粒技术

1.6 立题依据

2 材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 菌株

2.1.2 载体信息

2.1.3 主要仪器及试剂

2.1.4 实验常用溶液配制

2.2 实验方法

2.2.1 TEV酶蛋白的表达纯化

2.2.2 CCR4-NOT蛋白复合体的表达纯化

2.2.3 数据收集

3 结果与分析

3.1 TEV酶蛋白的活性检测结果

3.2 酿酒酵母生长曲线的测定情况

3.3 目的蛋白复合体的鉴定结果

3.3.1 SDS-PAGE胶验证及肽谱分析

3.3.2 Western Blot验证

3.3.3 NATIVE-PAGE胶验证及肽谱分析

3.4 蔗糖密度梯度离心纯化结果

3.5 负染电镜三维重构

3.5.1 负染样品结构分析

3.5.1 三维重构结果分析

4 讨 论

5 结 论

参考文献

致谢