产聚羟基丁酸(PHB)菌株的筛选鉴定及发酵工艺优化

摘要

聚羟基丁酸是一种生物可降解的高分子材料，可应用于医学、环境保护、农业等领域，其用途广泛，具有广阔的工业应用价值。本文研究了从化工厂污水中筛选出1株能够以甘油作为碳源来合成PHB的菌株。首先采用16S rDNA基因序列分析，确定该菌株属于假单胞菌科（Pseudomonadaceae）假单胞菌属（Pseudomonas），然后依据与其相关的生理生化特性试验，确定该菌为恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida），并将其命名为PP25。进行初步发酵试验，结果表明该菌以2％甘油作为主要碳源时，PHB产量为2.456g/L。
　　本研究主要内容包括：⑴建立紫外分光光度法及高效液相色谱法测定假单胞菌胞内的PHB含量。在紫外分光光度法的建立中以超声波破壁作为细胞破壁的预处理方法，考察了超声时间、三氯甲烷的蒸发时间、水浴时间、硫酸用量等因素，确定最优试验条件。紫外分光光度法于1.0~3.5μg/mL内呈线性关系。采用该方法对样品测定时的回收率是95.93%~104.79%，相对标准偏差是1.13%~4.27%。高效液相色谱法采用Aminex HPX-87C分析柱，采用紫外检测器对胞内的PHB进行分离测定。经过色谱条件优化，最终确定5 mmol/L硫酸作为流动相，流速选择0.7 mL/min，柱温选择50℃。采用高效液相色谱法检测样品时回收率是98.91%~101.97%，相对标准偏差是0.763%~2.014%。⑵研究了温度、摇床转速、初始 pH、接种量、装液量、碳源、氮源、无机盐、金属离子等因素对PP25生长及PHB积累的影响。然后依据Placket-Burman试验，筛选对PP25菌株合成PHB有显著影响的因素。结果表明：甘油，硫酸铵及初始pH3个因子对PP25菌株合成PHB有显著的影响。利用最陡爬坡试验及响应面分析法探究3个显著因素对PP25菌株积累PHB的关系。结果表明：当甘油为26.892 g/L，(NH4)2SO4为3.043 g/L，初始pH为7.004时，聚羟基丁酸最大估计值为8.062 g/L。经过对模型验证， PHB实际合成为7.881 g/L，与理论产量相似，比优化前提高了32.52%。最终确定最优的条件为是甘油26.892 g/L，柠檬酸2 g/L，(NH4)2SO43.043 g/L，Na2HPO4·12H2O15 g/L， NaH2PO2·H2O4 g/L，FeSO4·7H2O0.4 g/L，MgSO4·7H2O1.2 g/L，初始pH7.004。⑶探究了通气量、温度、pH对PP25菌株在5 L发酵罐中积累PHB的影响。结果表明：通气量选择1.2 vvm、温度选择28℃和pH选择6.5时，菌体生物量为18.04 g/L， PHB产量为10.617 g/L。比优化前分别提高了46.19%和78.95%。在此基础上，进行不同时间段补加甘油及补加不同C/N比的复合碳氮源补料工艺研究，确定在发酵24 h后补加C/N比为5:1的复合碳氮源（甘油60 g，硫酸铵12 g）时，比只补加甘油时分别提高了19.42%和19.11%。⑷研究了珠磨时间、珠磨质量、氯仿提取时间、温度、细胞浓度、醇沉时间及乙醇和氯仿相得比例对胞内PHB提取率的影响。结果表明珠磨时间3 min，珠磨量100 mg、氯仿提取时间78.3 min、温度54.5℃、细胞浓度20.5 mg/mL、氯仿相和乙醇比例1:4及醇沉时间70 min是胞内的PHB提取率最高为84.20%。经过纯化后 PHB的提取率为73.51%，PHB的纯度为98.97%。

目录

声明

1 绪论

1.1 聚羟基丁酸（PHB）概述

1.2 聚羟基丁酸（PHB）的应用

1.3 PHB的合成方法

1.4 PHB的检测方法

1.5 PHB的提取方法

1.6 微生物发酵法生产PHB的国内外进展

1.7 研究目的和意义

1.8 主要研究内容、技术路线

2 产聚羟基丁酸（PHB）菌株的筛选与鉴定

2.1 引言

2.2 材料与方法

2.3 实验方法

2.4 结果

2.5 结论

3 聚羟基丁酸（PHB）检测方法的建立

3.1 紫外分光光度法（UV）测定胞内PHB方法的建立

3.2 高效液相色谱法（HPLC）检测胞内的PHB方法的建立

3.3 结论

4 聚羟基丁酸发酵工艺的初步优化

4.1 引言

4.2 实验材料

4.3 实验方法

4.4 实验结果

4.5 结论

5 5 L发酵罐发酵生产PHB工艺研究

5.1 引言

5.2 材料与方法

5.3 结果与讨论

5.4 结论

6 PHB的提取工艺优化

6.1 引言

6.2 实验材料

6.3 实验方法

6.4 结果与讨论

6.5 结论

7 讨论

参考文献

致谢

攻读学位期间发表的学术论文