体细胞克隆牛、克隆猪的DNA甲基化与羟甲基化

摘要

随着克隆技术的不断发展，克隆技术面临的一些如个体成活率低、成活个体存在不同程度表型异常等问题日益得到重视，这一类表型异常和缺陷与基因组异常的甲基化所导致的症状相类似。DNA甲基化修饰与基因表达抑制相关，DNA羟甲基化功能虽研究较少，但它参与DNA去甲基化过程，极可能与促进基因表达相关。本实验从表观遗传学角度出发，选取DNA甲基化和羟甲基化这对紧密相连的表观遗传修饰作为研究对象，利用HPLC、LC-MS等技术探讨它们在整个基因组及特殊位点的修饰差异，探究造成这些差异的可能原因，最终目标将揭示DNA5mC与5hmC对克隆动物成活和发育的重要影响，为提高克隆效率提供理论指导。
　　本研究通过HPLC技术，建立了组织和细胞总DNA甲基化（5mC）含量检测方法，检测了不同供体核（胎儿成纤维细胞系FFB和输卵管上皮细胞系FOV）存活克隆牛基因组DNA甲基化水平，对于死亡克隆牛我们检测的组织包括：耳组织，还有肌肉、肺脏、心脏、脾脏和肝脏组织样。利用LC-MS技术，我们建立了组织和细胞总DNA羟甲基化（5hmC）含量检测方法。对于不同供体核克隆牛单基因位点的甲基化和羟甲基化检测我们采用氧化亚硫酸氢盐(oxBS-seq)法，完成了对印记基因H19和Xist的5mC和5hmC检测。通过检测发现无论存活还是死亡克隆动物（牛、猪）DNA5mC和5hmC均有异常，DNA5mC重编程不完全，表现在5mC含量比正常繁殖动物高；存活克隆动物也存在DNA甲基化重编程不完全现象，但不完全程度要低，主要表现在DNA甲基化水平虽高于正常繁殖动物，但是低于死亡克隆动物。对于5hmC研究发现，存活克隆动物5hmC含量高于死亡克隆动物，但低于正常繁殖动物，这说明克隆动物5hmC重编程也异常。通过对于单基因位点的检测发现H19 DNA5mC重编程异常对克隆牛存活和死亡贡献更大，存活克隆牛H195mC含量一般均低于50％，而死亡克隆牛5mC含量一般在70%附近，而Xist基因DNA5mC差别不大。

目录

声明

1.前言

1.1 表观遗传学

1.1.1基因组印记

1.1.2 X染色体失活

1.2 DNA甲基化与羟甲基化

1.2.1 DNA甲基化及其作用

1.2.2 DNA甲基化的检测方法

1.2.3 DNA羟甲基化和组蛋白H3 K27me3修饰相关性研究进展

1.2.4 TET蛋白家族的基本特征及其作用

1.2.5 羟甲基化的检测方法

1.3体细胞重编程

1.3.1体细胞重编程技术及体细胞克隆动物存在的问题

1.4立题依据和研究意义

2．实验材料和方法

2.1.1 主要仪器

2.1.2 主要试剂

2.1.3常用试剂的配制

2.1.4分析工具软件及网站

2.1.5实验用引物序列

2.2实验步骤

2.2.1实验材料的选取

2.2.2基因组DNA的提取和纯度检验

2.2.3单个位点DNA甲基化和羟甲基化检测

3.结果与分析

3.1利用高效液相色谱检测5mC总含量方法的建立

3.2利用LC-MS检测基因组中5hmC总含量方法的建立

3.3不同供体核存活和死亡克隆牛基因组DNA 5mC和5hmC的检测

3.4体细胞克隆猪基因组DNA 5mC和5hmC的检测

3.5体细胞克隆牛单基因位点DNA 5mC检测

3.6单碱基分辨率的甲基化和羟甲基化方法的建立

4.讨论

4.1关于LC-MS测定中的干扰和校正

4.2关于高效液相色谱的梯度洗脱

4.2关于KRuO4处理5hmC的讨论

5.结论

参考文献

致谢