克隆牛Xist基因DNA甲基化及表达分析

摘要

动物克隆的效率非常低可能是由于供体核重编程的不彻底或不适当造成的。雌性动物个体有两条X染色体，为了达到剂量平衡必须要失活其中的一条，在这一过程中，涉及复杂的表观修饰的变化。Xist(X inactivation-specific transcript)基因是X染色体失活启始的一个关键基因，没有它的表达，X染色体失活就不能正常启始。DNA甲基化是基因组中的一种重要的表观修饰，能调节基因的转录活性，很多研究已经提出哺乳动物无活性的X染色体的Xist基因全甲基化，而失活的全不甲基化，因此，Xist基因的活性与DNA甲基化非常相关。 我们这一研究的目的是检测在围产期死亡克隆牛和出生后死亡的克隆牛中Xist基因的DNA甲基化是否存在某些差异，如果有，这种差异是否影响其对应Xist基因的转录。通过预测，在靠近Xist基因启动子的区域找到了唯一一个CpG岛。在该研究中，我们所使用的样品是正常牛和克隆牛的心、肝、脾、肺和肾五种组织。依据我们的试验结果，从不同牛分组的Xist基因CpG岛平均的甲基化水平来看，无论是围产期死亡克隆牛，还是出生后死亡克隆牛都比正常对照牛的低。而且出生后死亡克隆牛的比围产期死亡克隆牛的还低。除此之外，我们还检测了两头雄性正常牛Xist基因的甲基化水平，结果发现，在雄性正常牛的五种组织中，Xist基因CpG岛基本都处于高甲基化状态(平均水平高于90％)。我们用荧光定量-反转录PCR的方法来检测Xist基因的转录水平，然而，意外的是，从平均水平来看，Xist基因DNA甲基化程度高的样品的Xist转录水平也高。这有可能是因为DNA甲基化在此阶段不能调节Xist的转录，或者DNA甲基化程度的降低还不足以使Xist的转录水平发生改变，也有可能是因为在这个阶段DNA甲基化外的其他表观修饰在调控Xist基因的转录水平上起更人作用，还有可能DNA甲基化主要用来预防Xist基因的意外转录，其具体作用还有待深入研究。另外，通过检测，Xist基因在雄性正常牛和克隆牛五种组织中几乎不转录，因此Xist基因在雄性正常牛和克隆牛的各组织中是沉默的。 除此之外，依据我们的结果，Xist基因的DNA甲基化和Xist的转录是有组织差异的。在正常牛和克隆牛中，Yist基因CpG岛的甲基化在脾和肝中是相对较高的，而在肺中是最低的。而对Xist的转录而言，在脾中的转录水平较高，而在心脏组织中较低。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章文献综述

第二章实验材料与方法

2.1实验材料

2.1.1菌株及质粒

2.1.2实验用酶

2.1.3药品和试剂

2.1.4免疫沉淀(ChIP)抗体及蛋白酶抑制剂

2.1.5培养基的配制

2.1.6试剂的配制

2.1.7引物设计及合成

2.1.8主要的仪器设备

2.2实验方法

2.2.1亚硫酸氢盐处理

2.2.2哺乳动物组织DNA的提取

2.2.3利用TRIZOL试剂盒提取总RNA

2.2.4总RNA的纯化

2.2.5反转录

2.2.6 DNA测序反应程序

2.2.7体细胞克隆牛技术简介

第三章实验结果

3.1克隆牛Xist基因DNA甲基化

3.1.1牛Xist基因5’调控区CpG岛的预测

3.1.2克隆牛Xist基因DNA甲基化研究

3.1.3克隆牛Xist基因DNA甲基化状况

3.1.3克隆牛Xist基因CpG岛DNA甲基化结果分析

3.2体克隆牛Xist基因表达分析

3.2.1样品mRNA的提取检测

3.2.2定量检测Xist基因的转录水平

第四章讨论与分析

4.1克隆牛Xist基因DNA甲基化研究

4.2克隆牛Xist基因表达分析

4.3克隆牛Xist基因表达与DNA甲基化的关系分析

参考文献

致 谢

简 历

附 录