肉牛肌生成抑制素成熟蛋白编码序列的克隆与原核表达

摘要

肌生成抑制素是转化生长因子-β超家族中的一个成员，它是肌肉生长的负调控因子。通过基因打靶技术获得的肌生成抑制素基因缺失鼠，其骨骼肌的数量呈现出明显而广泛的增加，而重量是正常小鼠的2-3倍；MSTN主要在成年动物的骨骼肌中表达，它的缺失及敲除可以使肉牛具有双肌表型，这种牛的骨骼肌重量较一般品种大20％左右，而脂肪含量较低，肉质性状优良。因此MSTN基因已成为目前畜禽肉质性状的最主要标记基因。研究MSTN的结构、构建其原核表达载体和功能，目的在于通过MSTN基因的抗体或抑制剂与MSTN基因结合，灭活其功能，安全高效地进行组织细胞营养代谢调控。对于提高肉用动物产肉量和瘦肉率，改善肉的品质，降低饲养成本等具有非常重要的理论意义和实际应用价值。 本研究利用Trizol法，从肉牛的骨骼肌中提取总RNA。RT-PCR法扩增出MSTNcDNA片段，并与pMD-18T载体相连接，转化E.coliJM109。通过PCR、酶切鉴定及序列分析，筛选阳性克隆。 从MSTNmRNA序列中设计引物上游5'端加BamHⅠ酶切位点和起始密码子ATG，下游5'端加SalⅠ酶切位点和终止密码子TTA，TCA。以MSTNcDNA为模板，PCR扩增MSTN成熟蛋白编码序列，用1％琼脂糖电泳回收PCR产物。将PCR产物与pMD-18T载体16℃过夜连接，将连接产物转化入用TSS法制备的感受态细胞中，将转化菌涂布在含有X-gal、IPTG和氨苄青霉素(Amp)的LB固体培养基上，37℃培养12～16小时，挑选白色菌落培养，采用碱裂解法提取质粒，经PCR和酶切鉴定，结果表明，以肉牛肌肉细胞总RNA为模板，扩增出的MSTN基因的cDNA序列，产物全长1128bp，编码375个氨基酸序列。成功地构建了牛pMD18-T-MSTN克隆质粒，测序分析结果与设计一致。 将克隆质粒pMD-18T-MSTN与原核表达载体pET28a(+)同时用TaKaRa公司的回收试剂盒回收牛MSTN目的片段及pET28a(+)载体，在T4DNA连接酶、双酶切的作用下将目的片段插入原核表达载体pET28a(+)的BamHⅠ和SalⅠ两酶切位点之间，转化后，挑选含有卡那霉素的菌落进行培养，提取质粒进行PCR和酶切鉴定，并测序分析，构建了牛MSTN成熟蛋白编码序列的原核表达质粒pET28a(+)-MSTN。然后将重组质粒转化大肠杆菌E.coliBL21(DE3)，并用IPTG于37℃诱导培养获得表达，SDS-PAGE分析显示，表达的牛MSTN基因重组蛋白分子量约为43.4kDa，与理论分子量相符。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩略语表

独创性声明及关于论文使用授权的说明

第一章文献综述

第二章肉牛MSTN成熟蛋白编码序列的克隆与序列分析

第三章肉牛MSTN成熟蛋白编码序列原核表达质粒构建与诱导表达

第四章分析与讨论

第五章结论

参考文献

致谢

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攻读硕士学位期间发表的学术论文