青霉素工业生产菌株—产黄青霉菌转基因体系的建立

摘要

本文从载体构建、转基因体系建立、启动子筛选评价等方面进行了实验，为开展产黄青霉工业生产菌株的代谢途径工程以及功能基因研究创造条件。 研究方法： 1.产黄青霉菌工业生产菌株耐药性调查，确定筛选标记。 2.通过PCR方法克隆抗性基因及不同基因的启动子。 3.不同调控元件产黄青霉菌转化载体的构建：以上述真菌基因转录的不同启动子构建转化产黄青霉菌载体。 4.产黄青霉菌工业生产菌株原生质体制备。 5.产黄青霉菌工业生产菌株原生质体转基因方法建立。 6.比较不同载体的转化效率及腐草霉素抗性表达的强弱，确定启动子的启动活性 研究结果：产黄青霉对腐草霉素非常敏感，10μg/ml的腐草霉素已经足以抑制NCPC-10086的生长。由此我们选择腐草霉素抗性作为筛选标记，克隆腐草霉素抗性的编码基因Shble编码区序列，选择异青霉素N合成酶(IPNS)基因pcbC的启动子Pipns、构巢曲霉3-磷酸甘油醛脱氢酶基因gpdA的启动子PgpdA、构巢曲霉色氨酸合成基因C的启动子PtrpC、粗糙脉胞霉氨基酸合成交叉途径控制基因cpc的启动子Pcpc为启动子，以trpC基因终止子TtrpC为终止子，构建了四个产黄青霉菌转基因载体。分别命名为pDHIB、pDHGB、pDHB和pDHCB。 本实验确立了丝状真菌产黄青霉菌原生质体制备的快速大量制备方法，在30℃温度下，1％Novozyme234酶中酶解3h，原生质体释放量可以达到7-8×107个/g湿菌丝，再生频率14％以上。该方法制备的原生质体数量、再生频率能够满足原生质体转基因方法的需要。 建立了PEG介导的工业生产菌株原生质体转基因方法，采用菌丝培养48小时、酶消化3小时的原生质体，DNA用量10-15ug，浓度50％PEG3500，转化效率可达到阳性克隆8个/ugDNA。通过腐草霉素抗性培养基选择，转化子有明显的区别，通过PCR分析，筛选到的转化子均为阳性克隆。 对构建的四种转化载体的转化效率进行了比较。根据转化效率载体可以分为两类，其中pDHCB和pDHGB的转化效率较为接近，转化效率分别为13.3、12个阳性克隆/ugDNA，是高效的转化载体。而pDHIB和pDHB载体的转化效率较为接近，转化效率分别为6.2、4.4个阳性克隆/ugDNA是低效的转化载体。对这四种质粒转基因所得的阳性克隆进行腐草霉素抗性调查，结果表明pDHGB的阳性菌落对腐草霉素的抗性最强，pDHCB其次，而pDHB的最弱。这与四种质粒的转基因效率的结果相符。这四种启动子强弱的顺序为Pgpd、Pcpc、Pipns和PtrpC。 研究结论：本实验以腐草霉素抗性基因作为产黄青霉菌转基因载体构建的选择标记。分别构建了以产黄青霉菌异青霉素N合成酶(IPNS)基因pcbC的启动子Pipns、构巢曲霉3-磷酸甘油醛脱氢酶基因gpdA的启动子PgpdA、构巢曲霉色氨酸合成基因trpC的启动子PtrpC、粗糙脉胞霉氨基酸合成交叉途径控制基因cpc的启动子Pcpc为启动子，腐草霉素(phleomycin)抗性基因为报告基因，构巢曲霉色氨酸合成基因trpC的终止子TtrpC为终止信号的丝状真菌转基因质粒。建立了产黄青霉菌原生质体转基因方法，通过比较不同载体的转化效率和转化子耐药敏感性，建立了产黄青霉菌工业生产菌种启动子筛选、评价体系，确定了四种不同基因启动子的强弱顺序为Pgpd、Pcpc、Pipns和PtrpC。

目录

引言

第一部分产黄青霉菌转基因载体的构建

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

第二部分产黄青霉菌转基因体系的建立

前言

材料与方法

结果

附图

讨论

小结

参考文献

第三部分产黄青霉菌基因报告系统启动子效率的评价

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

综述 青霉素生物合成研究及基因工程育种

致谢

个人简历