小鼠IL-23基因在小鼠结肠癌细胞中的表达及其抗肿瘤作用研究

摘要

本研究在已有工作的基础上首先以结肠癌细胞株(Colon26)为基础，构建表达IL-23的结肠癌细胞株(Colon26/IL-23)，为深入研究IL-23的抗肿瘤作用，皮下接种小鼠观察IL-23的抗肿瘤作用，并进一步探讨IL-23抗肿瘤过程中细胞凋亡的变化及细胞凋亡抑制因子Survivin的表达情况。 研究方法：将携带mIL-23的逆转录病毒包装细胞株(PA317/IL-23)在完全培养基DMEM中，37℃、5％CO2条件下培养24h，收集带有mIL-23基因的重组逆转录病毒的上清液。以polybrene介导将携带mIL-23基凶的逆转录病毒转染真核表达载体结肠癌细胞(Colon26)，经G418(400mg/L)筛选，得到稳定转染的阳性克隆细胞(Colon26/IL-23)。用DMEM培养这些稳定转染阳性克隆细胞，待细胞呈对数生长时，用饱和酚-氯仿法提取阳性克隆细胞DNA，PCR鉴定目的基因是否整合到小鼠结肠癌细胞基因组中。用Trizol提取阳性克隆细胞RNA，RT-PCR鉴定Colon26/IL-23目的基因mRNA的表达。用ELISA方法检测细胞培养上清液mIL-23分泌量。无菌取6周龄BALB/c小鼠脾脏，制成脾细胞悬液，加入Colon26/IL-23细胞培养上清液，培养48小时，收集上清液，用ELISA方法检测IL-23刺激脾细胞产生IFN-γ的含量。用MTT比色法检测Colon26/IL-23、Colon26和Colon26/LXSN的体外增殖反应。将上述三种细胞分别接种8-10周龄BALB/c小鼠，观察其致瘤作用，并用游标卡尺定期测量肿瘤大小，确定IL-23的抗肿瘤作用。8-10周龄BALB/c小鼠随机分为四组，分别皮下接种Colon26/IL-23、Colon26和Colon26/LXSN，接种后10天、20天、30天皮下取瘤组织用流式细胞仪检测瘤细胞凋亡率、用免疫组织化学的方法检测瘤细胞中细胞凋亡抑制因子Survivin的表达情况。 研究结果：含mIL-23的PA317/IL-23细胞培养上清液与小鼠结肠癌细胞共同培养获得稳定转染的阳性克隆细胞(Colon26/IL-23)，比较Colon26/IL-23、Colon26/LXSN与Colon26三种细胞的基凶组DNA，经PCR扩增后琼脂糖凝胶电泳，只在Colon26/IL-23细胞中扩增出长度约为581bp的mIL-23p19亚基基因的PCR产物。将三种细胞的总RNA经RT-PCR扩增后，进行琼脂糖凝胶电泳发现只在Colon26/IL-23细胞的RNA中有1条与mIL-23p19亚基基因大小相同的约581bp的带。只在Colon26/IL-23细胞的培养上清中检测到mIL-23的分泌，分泌量为(95±1.76pg/ml)。Colon26/IL-23细胞培养上清液刺激小鼠脾细胞IFN-γ分泌量显著高于Colon26/LXSN和Colon26的分泌量(P＜0.01)。三种细胞体外增值无明显差异(P＞0.05)、而在体内致肿瘤作用不司，在Colon26/IL-23细胞接种后的早期肿瘤生长的速度及大小与Colon26/LXSN和Colon26细胞接种组相似(P＞0.05)；在10d后，接种Colon26/IL-23细胞的小鼠肿瘤生长的速度变缓慢，接种后30d瘤体明显减小，42d开始有小鼠肿瘤消退(P＜0.01)。流式细胞仪检测，接种Colon26/IL-23细胞的小鼠肿瘤细胞凋亡率20天、30天有显著差异(P＜0.01)。免疫组织化学染色，接种Colon26/IL-23细胞的小鼠肿瘤细胞Survivin的表达率与其它组相比20天、30天有显著差异(P＜0.01)。细胞凋亡率和Survivin的表达率作相关分析，二者呈显著负相关关系，相关系数r=-0.6181。 研究结论：成功的构建了Colon26/IL-23细胞，为深入研究IL-23抗肿瘤作用奠定了基础。通过体外刺激IFN-γ分泌和体内抑制肿瘤生长的研究，充分证明IL-23具有抗肿瘤作用。进一步研究IL-23抗肿瘤对细胞凋亡的影响发现，随着IL-23治疗作用的延长，Survivin的表达率逐渐减少，细胞凋亡率逐渐增加，总之，IL-23的抗肿瘤作用可能是由于抑制的Survivin表达，从而解除了Survivin对细胞凋亡的抑制使细胞凋亡增加，发挥抗肿瘤作用。

目录

第一部分逆转录病毒介导的小鼠IL-23基因在小鼠结肠癌细胞中的表达

前言

材料与方法

结果

附图

讨论

参考文献

第二部分逆转录病毒介导的小鼠L-23基因对小鼠体内结肠癌生长的抑瘤作用

前言

材料与方法

结果

附图

讨论

参考文献

第三部分逆转录病毒介导的小鼠IL-23基因对小鼠结肠癌细胞凋亡率及凋亡抑制蛋白Survivin表达的影响

前言

材料与方法

结果

附图一

附图二

附表

讨论

参考文献

综述IL-2和IL-12联合抗肿瘤作用

致谢

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