中药双黄补对体外原代培养人牙髓细胞增殖和超微结构影响的研究

摘要

目的：牙髓细胞是牙髓组织的主体细胞，是牙体组织损伤再生修复能力的重要成份。提高牙髓细胞增殖活性有利于牙髓组织修复过程的顺利进行。因此，体外培养牙髓细胞，揭示牙髓细胞的增殖、分化特性对牙髓组织的损伤修复具有重要意义。中药作为天然药物因其具有毒副作用较小的优点而越来越受到人们的欢迎，从天然药物中寻找新的有效药物正成为全世界医药学的研究热点。本实验采用组织块法原代培养人牙髓细胞，观察人牙髓细胞的生物学特性，为牙髓组织工程的发展奠定基础。提取中药黄连、黄芩、骨碎补复合制剂有效成分，作用于体外培养的人牙髓细胞，四唑盐比色法(MTT)检测、超微结构下观察以阐述中药双黄补对人牙髓细胞增殖特性的影响。最终为牙髓组织的损伤修复寻找最佳治疗用药。 方法： 1牙髓细胞原代培养及细胞生长特性 1.1牙髓细胞原代培养和传代选择20岁以下正畸待拔除牙或待拔除阻生智齿。口腔常规消毒，拔牙后立即移入超净工作台。牙钳钳开，拔出牙髓，去除根尖部2mm牙髓组织，将牙髓组织剪碎平铺于25ml培养瓶底，加含20％胎牛血清(FBS)的DMEM，倒置于培养箱，3h～4h后翻瓶。观察细胞游出和生长情况。待细胞长满约瓶底80％时消化传代。 1.2牙髓细胞贴壁率的测定取第4代生长状态良好的人牙髓细胞，以1×105/ml接种24孔培养板，选取2、4、6、8、10、12、14h时的时问点吸弃培养液，胰酶消化，计数，计算贴壁率。 1.3牙髓细胞分裂指数的测定取第4代生长状态良好的人牙髓细胞，以2×104/ml接种于预先放有盖玻片的12孔板中。每24h取出1张盖玻片，连续取7d，固定，HE染色。镜下计数1000个细胞中的分裂相，计算分裂指数。 1.4绘制生长曲线取第5代生长状态良好的人牙髓细胞，以3×104/ml接种于24孔板，每3孔为一组，每天取一组，连续取7d，消化计数，绘制生长曲线。 2双黄补对人牙髓细胞增殖及超微结构的影响 2.1双黄补提取液的制备将黄连、黄芩、骨碎补按一定比例混合，水提醇沉法配制成质量浓度每毫升含1g生药的药液，脱色、过滤。用含2％FBS培养基稀释到相应终浓度(分别为10μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、500μg/ml、1000μg/ml)。分装，4℃保存备用。 2.2MTT法检测人牙髓细胞增殖活性取第4代生长状态良好的人牙髓细胞，接种于96孔板。随机分为6组，每组5孔，孵育72h后加入不同浓度双黄补提取液培养基，继续孵育48h后，MTT法酶联免疫检测仪490nm波长测各孔OD值。 2.3扫描电镜观察取第5代生长状态良好的人牙髓细胞，接种于预先放有盖玻片的6孔板中。随机分为对照组和实验组。孵育72h后加不同浓度双黄补提取液培养基培养7d，取出盖玻片，洗涤固定，常规制备样品，扫描电镜观察。 2.4透射电镜观察取第5代生长状态良好的人牙髓细胞，接种在50ml培养瓶中，随机分为实验组和对照组，孵育72h后加不同浓度双黄补提取液培养基培养7d，细胞刮刮取细胞，洗涤固定，常规制备样品，透射电镜观察。 结果： 1原代培养接种3d～7d后可见梭形、多角形细胞从组织块周围游出，逐渐增多后，排列紧密有极性。细胞游出约2周后1：1传代，传代后细胞生长迅速，约每周传代一次。 2牙髓细胞贴壁率牙髓细胞接种后成圆球样飘浮于培养液中，以后逐渐贴附伸展，接种14h时细胞贴壁率达78％。24h后成活细胞全部贴壁，未贴壁细胞视为死细胞。 3牙髓细胞分裂指数和生长曲线接种2d后细胞进入增殖旺盛期，处于分裂相细胞增多，第四天达最高34.33‰。生长曲线也显示接种第一、第二天细胞生长缓慢，从第三天起细胞进入对数生长期。 4牙髓细胞增殖测定经酶标仪于492nm处读数，对照组的OD值为0.141，10μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、500μg/ml、1000μg/ml双黄补实验组的OD值分别为0.165、0.178、0.167、0.164、0.137。经检验10g/ml、50μg/ml、100μg/ml浓度双黄补实验组人牙髓细胞生长速度均高于对照组，差异有显著性(P＜0.05)。在浓度为50μg/ml时对人牙髓细胞增殖效果最为显著(P＜0.01)。 5扫描电镜观察实验组与对照组相比，细胞表面有丰富的枝状嵴，交织成网状，嵴上附大量微小囊泡。细胞周围可见细胞外基质。 6透射电镜观察实验组与对照组相比，细胞器增多，胞质内有丰富的粗面内质网和游离核糖体等。粗面内质网显著扩张成大泡状。细胞核内常染色质均匀分布，异染色质较少。 结论： 1组织块法原代培养人牙髓细胞简便易行，且较好的保持了与源组织相近的生物学特性，是比较理想的原代细胞培养方法。 2中药双黄补提取液在一定浓度范围内对人牙髓细胞有促增殖作用，且呈浓度依赖性。在该浓度范围内，电镜下观察显示人牙髓细胞内细胞器数量增加，功能增强。

目录

摘要

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

结论

参考文献

综述牙髓细胞原代培养的研究展

致谢

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