三种牙髓治疗材料对体外培养的人牙髓细胞及牙周韧带细胞增殖和分化影响的研究

摘要

本研究拟在体外分别培养人牙髓细胞(humanDentalPulpCells，hDPCs)和人牙周韧带细胞(humanPeriodontalLigamentCells，hPDLCs)，研究氢氧化钙、羟基磷灰石、三氧化矿物凝聚体三种材料浸提液对hDPCs和hPDLCs增殖、分化以及p38MAPK信号蛋白表达的影响，从细胞水平和分子水平比较这三种材料的生物活性，初步探讨生物材料诱导细胞成骨分化的机制。　　研究材料和方法： ①用组织块法和酶消化法进行人hDPCs的原代培养，用组织块法进行牙周韧带细胞的原代培养，倒置显微镜观察细胞生长状况，取第5代hDPCs和hPDLCs用细胞计数法测定细胞的生长曲线，用SABC法进行波形丝蛋白和角蛋白免疫组化染色进行细胞来源鉴定。 ②配制氢氧化钙、纳米羟基磷灰石、三氧化矿物凝聚体三种材料浸提液，按体积分数稀释成不同浓度。取第5代hDPCs和hPDLCs，消化后以2×104个/mL的密度接种于96孔培养板中，分别用不同浓度的材料浸提液培养，收集培养第2d、4d、6d、8d的细胞，用MTT法测定细胞的增殖情况。 ③取第3代hDPCs和hPDLCs，消化后以5×104个/mL的密度接种于96孔培养板中，分别于培养的3d、6d、9d测定各材料浸提液培养细胞的ALP活性，以研究细胞分化的情况。 ④用各材料浸提液培养hDPCs和hPDLCs，用VonKossa染色检测钙化结节的形成，用免疫组化染色检测骨钙蛋白(Osteocalcin，OCN)的表达。⑤用Western-blot检测Ca(OH)2和MTA浸提液对细胞p38MAPK蛋白的表达，并分别以矿化诱导液和DMEM作为阳性对照和阴性对照。 ⑤在MTA浸提液和矿化诱导液中加入不同浓度的SB302580后与hDPCs和hPDLCs共培养，检测SB302580对细胞ALP活性的影响。 研究结果： ①hDPCs最早在第6d长出，呈梭形，核仁清晰，胞浆丰满。一般于15-20d长满瓶底，可进行传代；酶消化法可在消化后2d见到细胞贴壁。hPDLCs最早在第4d长出，细胞呈长梭形，可见多边形及三角形细胞，一般于12-15d可长满瓶底进行传代。免疫组化染色结果显示hDPCs和hPDLCs波形丝蛋白为阳性，抗角蛋白染色为阴性。 ②用MTT法检测细胞培养的第2d、4d、6d、8d的活性，结果表明Ca(OH)2组细胞OD值明显低于其它各组(P＜0.05)，其它各组之间OD值大小无差别(P＞0.05)，材料浸提液的浓度对所培养细胞OD值大小无明显影响(P＞0.05)，HDPCs组与HPDLCs组细胞的OD值差别不大(P＞0.05)。 ③检测细胞培养的3d、6d、9dALP的活性，结果表明MTA组细胞的OD值高于Ca(OH)2组和n-HA组(P＜0.05)，Ca(OH)2组细胞ALP活性的相对增长率高于完全培养液组和n-HA组，低于MTA组(P＜0.05)。MTA浸提液培养9d后HDPCs细胞ALP活性OD值略低于HPDLCs(P＜0.05)。 ④MTA浸提液培养的hDPCs和hPDLCs，VonKossa染色和OCN免疫组化呈阳性，其它组为阴性。 ⑤hDPCs和hPDLCs中p38MAPK的表达在换液后3h达到最高，MTA浸提液培养的细胞中有p38MAPK的表达，Ca(OH)2组细胞则无表达。⑤矿化诱导液和MTA浸提液中加入SB302580时，所培养的细胞ALP活性OD值呈浓度依赖性下降。 研究结论： ①用组织块法和酶消化法成功培养出人牙髓细胞；用组织块法成功培养人牙周韧带细胞。 ②Ca(OH)2对两种细胞的增殖均有较强的抑制作用，但可促进存活细胞的分化。 ③n-HA对细胞的增殖和分化无明显促进作用，也无明显抑制作用。 ④MTA对hDPCs和hPDLCs的增殖无抑制，可以诱导细胞成骨分化或矿化分化。 ⑤hDPCs和hPDLCs对材料增殖敏感性无差异，在MTA和矿化诱导培养下hPDLCs分化的能力略强于hDPCs。 ⑥MTA诱导人hDPCs和hPDLCs成骨分化或矿化分化的生物活性作用可能依赖于p38MAPK信号通路的激活。

目录

文摘

英文文摘

前 言

第一章人牙髓细胞和人牙周韧带细胞的原代培养

第二章三种材料对hDPCs和hPDLCs增殖、分化的影响

第三章MTA和Ca(OH)2对体外培养的人hDPCs和hPDLCs表达p38MAPK影响的研究

全文结论

参考文献

附图

英文缩略词表

综述 三氧化矿物凝聚体在牙髓治疗中的应用及其生物活性评价

致谢